On the search for multitarget inhibitors for BACE‐1 and other pharmacological targets of Alzheimer's Disease

Resumen

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una patología neurodegenerativa caracterizada por la formación progresiva de placas amiloides insolubles y ovillos neurofibrilares, que afecta principalmente a la población de la tercera edad. A pesar del enorme esfuerzo de las instituciones académicas y la industria farmacéutica, no existen terapias conocidas que modifiquen el curso de la enfermedad. Los únicos fármacos que se usan clínicamente tienen un efecto paliativo de la sintomatología. La hipótesis más aceptada para la etiología de esta enfermedad se conoce como la hipótesis amiloide. De acuerdo con esta hipótesis varias biomoléculas cooperan en la generación de péptidos Aß y en su agregación. Los oligómeros resultantes poseen una alta toxicidad debido a su habilidad para interrumpir los contactos sinápticos. La multiplicidad de dianas amiloides abre la posibilidad de terapias multidiana en las cuales se buscarían moléculas que sean capaces de unirse a las diferentes dianas de la cascada amiloide. La barrera más obvia para la búsqueda de estos compuestos con capacidad polifarmacológica son las diferencias sustanciales en los sitios de enlace de las dianas. Por ello hemos decidido estudiar en detalle la unión de ligandos a estas biomoléculas antes de iniciar la búsqueda de fármacos multidiana. En primer lugar nos centramos en BACE-1, una enzima que participa en la etapa limitante de la hidrólisis de la proteína precursora amiloide que da lugar a la formación de péptidos amiloides. BACE-1 posee un par de residuos Asp que son esenciales para la actividad hidrolítica de esta enzima. Usando ensayos de evaluación de afinidades enzima-inhibidor por SPR en combinación con cálculos de dinámica molecular, fuimos capaces de demostrar que cada inhibidor induce estados de protonación diferentes en la diada aspártica catalítica, un rasgo que depende de la estructura del isóstero cuando los ligandos son peptídicos. En esta enzima y en otra de la misma familia (proteasa del virus del SIDA) hemos sido capaces de predecir entre otras cosas el efecto del pH sobre la afinidad de los ligandos. En BACE-1 hemos identificado isóteros (con un grupo hidroxilamina) que mantienen la afinidad a pH ácido y a pH neutro, una característica que las hace ideales para tener buena actividad a nivel celular. Este tipo de isóstero nos sirvió posteriormente para formular un farmacóforo de partida para la búsqueda de compuestos multidiana. En el siguiente paso hemos desarrollado un protocolo de acoplamiento enzima-inhibidor para BACE-1. Estos estudios nos permitieron determinar el efecto de la protonación del ligando y de los residuos ionizables de la enzima en los resultados teniendo en cuenta el efecto del pH sobre la predicción de las poses, y nos llevaron a proponer una función de evaluación de la afinidad del ligando basado en cálculos de mecánica molecular que enriquece substancialmente el número de poses correctas. Para evitar el problema que nos plantea las diferencias substanciales entre los sitios de unión de ligandos de las diferentes dianas moleculares propusimos un protocolo asistido por ordenador basado en un farmacóforo, que incluye ciertas interacciones específicas con las dianas de la cascada amiloide. La búsqueda se realizó por una combinación de protocolos de acoplamiento proteína ligando y de dinámica molecular. El farmacóforo original nos permitió identificar una serie de compuestos derivados de dimebon que poseen propiedades neuroprotectoras y neurogeneradoras en ratones, pero cuyas dianas no se conocían. Nuestros cálculos indicaron que estos compuestos originales eran inhibidores de dianas colinérgicas, un resultado que fue verificado experimentalmente. Dos ciclos de diseño basados en nuestros protocolos nos condujeron a nuevo grupo de análogos, los cuales fueron sintetizados y ensayados. Los resultados de los ensayos revelaron que los inhibidores de tercera generación mejoran su afinidad por BACE-1 por más de tres órdenes de magnitud, manifestando que nuestros compuestos además inhiben la agregación amiloide y son capaces de unirse a AChE y BuChE, lo que los convierte en compuestos multidiana que interfieren en la cascada amiloide además de tener un efecto colinérgico positivo.