Caracterización de marcadores peptídicos para la identificación de especies de langostinos de interés comercial

Resumo

Caracterización de marcadores peptídicos específicos para la identificación de especies de langostinos de interés comercial La autenticidad alimentaria tiene en la actualidad gran relevancia en el sector pesquero, debido a la sustitución, inadvertida o malintencionada, de unas especies por otras, en mayor medida cuando se trata de productos elaborados en los que las características externas han sido eliminadas. Además, la correcta identificación de los ingredientes de un producto es importante no sólo por razones económicas, sino también por razones sanitarias, debido a la introducción de algún componente alergénico o tóxico para algún sector de la población. Por todo ello, es necesario disponer de herramientas analíticas fiables y rápidas para identificar los componentes de los alimentos.En la actualidad, dentro del mercado de los productos pesqueros, los langostinos y gambas, crustáceos del orden Decapoda, son el producto más importante en valor económico, representado el 17% del total de este mercado internacional en 2006.. El trabajo realizado propone la utilización de técnicas proteómicas para la identificación y autentificación de especies de langostinos de interés comercial, siendo el objetivo principal la descripción de metodologías que nos permitan distinguir entre estas especies. Como primer resultado de esta Tesis Doctoral, se ha descrito una metodología que nos permite distinguir entre 14 especies de langostinos de interés comercial, utilizando isoelectroenfoque. Además, las proteínas que nos permiten diferenciar entre estas especies utilizando esta metodología fueron identificadas como distintas isoformas de la Sarcoplasmic Calcium-binding Protein (SCP). Por otra parte, mediante electroforesis bidimensional de los extractos sarcoplásmicos de 7 de estas especies -Penaeus monodon, Litopenaeus vannamei, Farfantepenaeus notialis, Fennerpenaeus indicus, Fenneropenaeus merguiensis, Pleoticus muelleri e Pandalus borealis-, se identificó una proteína potencialmente diferenciadora, la arginina quinasa (AK), que se seleccionó para el posterior análisis por espectrometría de masas. Esta proteína, aislada en los geles de electroforesis, se sometió a digestión con tripsina, y los péptidos resultantes se sometieron a análisis por MALDI-TOF, obteniendo los espectros de la huella peptídica de la arginina quinasa de cada una de estas siete especies. Los espectros de huella peptídica fueron analizados visualmente y se identificaron picos especie-específicos. Además, se desarrolló una metodología para comparar matemáticamente dichos espectros, obteniendo un dendrograma con utilidad tanto para identificar especies como para estudios taxonómicos y filogenéticos, ya que dicho dendrograma se comparó y validó con un árbol filogenético que se obtuvo a partir de los datos de las secuencias de ADN. Por otra parte, los picos especie-específicos identificados utilizando MALDI-TOF, se caracterizaron por medio de espectrometría de masas de tipo ESI-IT acoplada a HPLC. Así se obtuvo la secuencia de varios péptidos especie-específicos, que pueden ser utilizados como marcadores de la presencia de una de estas especies en una muestra. Estos péptidos caracterizados nos permiten distinguir entre las 7 especies, además de entre las tres familias a las que pertenecen dichas especies. Además, se encontraron diferencias intra-especificas en algunos péptidos pertenecientes a dos de las especies estudiadas, que nos permiten hacer una distinción en función de la población de la que provenga la muestra. Una vez caracterizados estos péptidos, se ha desarrollado una metodología sencilla, rápida y eficiente que logra la identificación de la especie presente en una muestra en 90 minutos, en cualquier producto ya sea fresco, refrigerado, congelado y/o procesado. Para ello se aceleró la digestión proteica mediante ultrasonidos de alta intensidad focalizados, y se utilizó un espectrómetro de masas en modo SMIM para la detección y monitorización de los péptidos. Dicha metodología supone una alternativa a los métodos existentes -análisis de ADN, mediante secuenciación directa o mediante reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP)-, mejorando la rapidez en el diagnóstico y la sencillez en el análisis. El gran avance de esta aproximación proteómica es que constituye el primer paso hacia el diseño de kits de detección basados en anticuerpos que reconozcan lo péptidos específicos de una manera rápida, barata y sencilla. Los métodos de identificación de especies aquí descritos, así como el conocimiento generado, tienen aplicación, además de en investigación científica, en los sectores alimentario, importador, sanitario, y de control de calidad.