Cuantificación de histamina y vesículas extracelulares mediante inmunoensayos magnéticos de flujo lateral

Resumo

En las últimas décadas existe una demanda creciente de sistemas de detección descentralizados que permitan un análisis rápido e in situ de analitos de interés en diferentes campos de aplicación, como puede ser el sanitario, alimentario o medioambiental. El uso de dispositivos bio-analíticos o biosensores portátiles, de fácil uso, rápidos y robustos para tomar decisiones “en el punto de atención” hace frente a esta demanda creciente. Los inmunoensayos de flujo lateral (LFIA) se encuentran entre los tests descentralizados (que pueden utilizarse fuera de laboratorios especializados) más utilizados. El ejemplo más relevante y utilizado por la población es el test de embarazo. Para extender el uso de este tipo de ensayos, es necesario superar algunas limitaciones, mejorando su sensibilidad y dotándolos de capacidad cuantificadora. En este trabajo se han afrontado estos dos retos usando nanopartículas superparamagnéticas como marcas de detección. El objetivo general de esta tesis es el desarrollo de inmunoensayos magnéticos de flujo lateral para la detección y cuantificación de moléculas y proteínas de interés en diferentes ámbitos de aplicación como es el biosanitario y alimentario. La cuantificación de las nanopartículas superparamagnéticas se llevó a cabo con un sensor inductivo desarrollado por nuestro grupo de investigación. En primer lugar, se describe un estudio con nanopartículas multi-core magnéticas (nanoflowers) recubiertas de una capa de carbono para su utilización como marca de detección en inmunoensayos de flujo lateral. Este trabajo incluye diferentes técnicas para la caracterización de las nanopartículas, tanto, en disolución como en la tira de flujo lateral. Con el sistema modelo de afinidad biotina-neuatrvidina se demuestra el potencial de estas nanopartículas como marca detección óptica para este tipo de inmunoensayos. Como prueba de concepto, se utiliza esta marca de detección para el desarrollo de un LFIA para la determinación de vesículas extracelulares en plasma. Si bien las propiedades ópticas de estas nanopartículas son muy buenas para su detección por reflectancia, las características magnéticas de los núcleos de magnetita resultan insuficientes para una detección magnética óptima. Para mejorar esta última, se sustituyeron las nanoflores de carbono por otro sistema en el que el núcleo de magnetita está formado por nanopartículas con mayor imanación a saturación. Al mismo tiempo, se persiguió evaluar un recubrimiento consistente en una doble capa de ácido oleico. Con el uso de estas nanopartículas se ha abordado el desarrollo de un LFIA magnético con formato sándwich para la determinación de vesículas extracelulares aisladas de plasma de pacientes con cáncer colorrectal. Estudios recientes muestran que el número de vesículas por encima de un valor umbral se puede relacionar con la presencia de tumores, por lo que un biosensor para su cuantificación tendría gran impacto para diagnóstico. Este tipo de nanopartículas superparamagnéticas permiten una buena detección magnética gracias a las características de estas. Promovido por los buenos resultados obtenidos con este tipo de nanopartículas, se han empleado para el desarrollo de un LFIA magnético con formato competitivo para la determinación de la amina biógena histamina, analito de interés en el campo de seguridad alimentaria por su acción alérgica. Se ha aplicado este sistema a muestras reales de vino tinto. Los resultados han sido validados mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los datos obtenidos en varios vinos en distinto punto de su elaboración muestran la utilidad de este biosensor para monitorizar histamina en bodegas sin necesidad de un laboratorio central. El último capítulo recoge resultados preliminares sobre varias líneas de investigación que se han identificado durante la realización de este trabajo. Por un lado, los primeros resultados, desarrollados en una breve estancia en Dublin City University, hacen referencia al diseño de una plataforma electroquímica para la cuantificación de nanovesículas. Se han utilizado liposomas y niosomas como estándar analítico mimético para vesículas extracelulares. Por otro lado, la necesidad de mejoras de sensibilidad identificadas durante este trabajo podría abordarse mediante sistemas de amplificación química relacionados con las nanopartículas magnéticas (MNP) utilizadas como marca de detección. La actividad enzimática peroxidasa de las partículas magnéticas se ha comprobado que puede mejorar la señal óptica en las tiras de flujo lateral. Para mejorar la señal magnética se han encapsulado MNP en liposomas como sistema de múltiples marcas de detección. Finalmente se incluye una sección que engloba una discusión conjunta, las conclusiones y los posibles trabajos futuros.