Síntesis y evaluación de ligandos con bases Janus para el reconocimiento de los pares U.U y C·U característicos de los RNAs tóxicos asociados a las distrofias miotónicas

Abstract

Entre los desórdenes causados por la expansión de repeticiones de trinucleótidos (TRED) se encuentra la Distrofia Miotónica de tipo 1 (DM1) causada por la expansión del triplete CTG y la Distrofia Miotónica de tipo 2 (DM2) causada por la repetición del tetranucleótido CCTG. Ambas afecciones son desórdenes multisistémicos con poca prevalencia en la población. Existen convincentes evidencias de que ambas patologías están causadas por los tránscritos de ARN expandido CUGexp y CCUGexp, respectivamente. El tránscrito de CUGexp forma una estructura secundaria de tipo horquilla en la que el tallo es muy similar a la forma A de un dúplex del ARN y contiene pares no canónicos U·?U flanqueados por dos pares canónicos G?C consecutivos. La estructura del tránscrito de CCUGexp es parecida, pero contiene dos pares no canónicos C·?U consecutivos entre dos pares G-­?C. Estas estructuras secundarias secuestran una proteína reguladora del procesado alternativo del ARN (MBNL1), afectando con ello las funciones celulares y causando el desarrollo de las enfermedades. Una buena aproximación para remediar estas patologías es utilizar pequeñas moléculas con gran afinidad por los tránscritos CUGexp y CCUGexp que sean capaces de desplazar MBNL1 o bloquear su unión. En este contexto, en la presente tesis doctoral se ha diseñado y validado una estrategia para reconocer los ARNs expandidos asociados a las distrofias miotónicas (DMs) mediante ligandos con estructura de poliamida (tipo PNA) que contienen las bases Janus 2,4,6-­?triaminopirimidina (JT) y 6-­?diamino-­?4-­?pirimidona (JD), que son capaces de unirse a los apareamientos no canónicos U·?U y C·?U, respectivamente. Cada una de ellas es capaz de introducirse entre las dos bases que conforman el par no canónico correspondiente y establecer un total de seis enlaces de hidrógeno al interaccionar como cuña Janus con ellos. Se han sintetizado los monómeros de PNA de ambas bases Janus y se han introducido mediante síntesis en fase sólida en oligómeros PNA de distinta longitud. Se han diseñado ligandos monoméricos, que contienen solo una de las bases, o diméricos, formados por dos módulos Janus ensamblados consecutivamente o separados mediante un espaciador de residuos de glicina. La afinidad y la selectividad de los ligandos se ha evaluado mediante técnicas biofísicas con dianas modelo de ARNs estructuradas como horquilla y que contienen dos repeticiones CUG o CCUG. Las técnicas biofísicas utilizadas han sido la desnaturalización térmica controlada por UV, el dicroísmo circular (DC), la calorimetría de valoración isotérmica (ITC), la resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectrometría de masas (EM). Las afinidades de los ligandos diméricos, tanto con Janus JT como JD por sus ARN diana son elevadas, habiéndose determinado que los complejos tiene constantes de disociación del orden ?M bajo. Sin embargo, la unión de los ligandos no modifica sustancialmente la estructura de horquilla de las dianas ni afecta a su estabilidad térmica. Por otro lado, los ligandos presentan selectividades importantes por sus respectivas dianas modelo de DM frente a otros ARN, lo que indica que se unen preferentemente a los pares no canónicos U·?U y C·?U frente a los pares canónicos de la misma diana o frente a otros motivos estructurales de ARN. En resumen, los ligandos preparados y evaluados pueden considerarse unos buenos cabezas de serie para el desarrollo de fármacos contra las DMs.