Péptidos miméticos con capacidad de atravesar barreras biológicas

Resumo

Péptidos miméticos con capacidad de atravesar barreras biológicas El estudio de los ¿-péptidos miméticos basados en cis-¿-amino-L-prolina con capacidad de atravesar la membrana celular en diferentes organismos, constituye una temática de gran interés en el área de biomedicina para su futuro desarrollo como transportadores moleculares. Estos análisis ayudan a profundizar y entender, como las características intrínsecas de cada compuesto asociadas a su estructura, constituyen factores cruciales para su desarrollo como transportadores. Como continuación de una línea de trabajo de nuestro grupo de investigación, en esta tesis doctoral se estudió el uso de ¿-péptidos seleccionados como potenciales transportadores en distintos tipos de barreras biológicas, como la membrana citoplasmática de distintos tipos de células (HeLa y MAEC), del parásito Leishmania donovani y de la barrera hematoencefálica (BHE) utilizando Drosophila melanogaster como modelo. Los resultados del estudio de entrada de estos péptidos a las células HeLa mediante citometría de flujo y microscopía confocal, demostraron que del conjunto de ¿-péptidos estudiados, sólo tres de estos presentaron un porcentaje de entrada celular superior al 50% con respecto a CF-Tat, a las dos horas de incubación. Mientras que al aumentar el tiempo de incubación a 24 h se favoreció la entrada de cinco ¿-péptidos en comparación al control CF-Tat. Esto sugiere que la presencia de grupos alifáticos en la cadena, aunque propician una entrada más lenta al interior de la célula, favorecen su permanencia en esta a tiempos más largos. Los ¿-péptidos probados internalizan en estas células mediante procesos endocíticos por dos o más mecanismos de entrada que incluyen la vía caveola, clatrina y macropinocitosis. Además, se determinó la capacidad de estos compuestos de internalizar en un cultivo primario de células MAEC, las cuales constituyen el modelo in vitro para estudiar la enfermedad de Fabry. En estas células se favoreció la entrada de los ¿-péptidos que presentaban grupos guanidinios. Por otra parte, se estudió la relación correspondiente al número de residuos guanidilados/capacidad como CPPs de la familia de ¿-péptidos frente a Leishmania donovani, determinándose que la capacidad de entrada a los promastigotes fue proporcional al número de residuos guanidilados, pero también aumenta la toxicidad de estos compuestos. El ¿-péptido con seis grupos guanidinios en su estructura, resultó el mejor candidato para su evaluación como transportador de fármacos, empleándose para formar conjugados con la doxorubicina y mitelfosina, los cuales se evaluaron frente a promastigotes de este parásito. El conjugado con la doxorubicina mostró una marcada actividad leishmanicida a las 4 h de incubación a concentraciones inferiores a 10 ¿M (IC50= 6 ¿M). También, se demostró que su internalización ocurre mediante un mecanismo dependiente de energia. El conjugado del ¿-péptido con miltefosina marcada con BODIPY frente a cepas de Leishmania donovani resistentes a miltefosina presentó actividad leishmanicida a concentraciones ¿5 ¿M, mientras que frente a MT libre se observó la resistencia esperada en el mismo rango de concentración. Este hecho demostró las aptitudes del péptido como transportador de fármacos frente a la resistencia farmacológica desarrollada por el parásito. Finalmente, se estableció una metodología para estimar la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE), utilizando a Drosophila melanogaster como modelo in vivo, siete péptidos modelos y seis ¿-péptidos, basándonos en técnicas de microscopía de fluorescencia. Los resultados de epifluorescencia de la retina, constituyeron una primera aproximación a la capacidad de este modelo in vivo, aunque no pueden considerarse concluyentes. La microscopía confocal de barrido de láser permitió validar a Drosophila melanogaster como modelo apropiado para estudiar la permeabilidad de la BHE frente a diferentes compuestos, mediante estudios tanto cualitativos como cuantitativos. El trabajo desarrollado permite concluir, que algunos de los ¿-péptidos seleccionados fueron capaces de atravesar la membrana plasmática de células HeLa y MAEC, de promastigotes de Leishmania donovani, así como la BHE de Drosophila melanogaster. Estos resultados, abre nuevos horizontes para la utilización de estos compuestos como transportadores de fármacos y/o nanotransportadores.