Identificación y caracterización de epítopos del rinovirus humano

Resumo

Los rinovirus humanos (HRV) son los responsables de la mayor parte de infecciones del tracto respiratorio. Como en cualquier infección viral, la inmunidad adaptativa frente a los HRV está mediada por linfocitos T y B, que reconocen regiones específicas en los antígenos conocidas como epítopos. Los esfuerzos iniciales en caracterizar la respuesta adaptativa frente a HRV se centraron en identificar epítopos B en las proteínas de la cápside que pudieran ser reconocidos por anticuerpos circulantes. Desafortunadamente, las proteínas de la cápside son muy variables entre diferentes serotipos y como resultado, los anticuerpos neutralizantes exhiben poca o nula reactividad cruzada entre distintos serotipos. Interesantemente, se ha demostrado que los linfocitos T CD4 y CD8 sí pueden reconocer múltiples serotipos, revelando la existencia de epítopos T conservados de HRV. Hasta ahora, tan solo se habían identificado unos pocos epítopos T CD4 conservados de HRV y, sorprendentemente, no se conocía ningún epítopo T CD8 de HRV. En esta tesis, abordamos la identificación y caracterización de epítopos T y B conservados en múltiples serotipos de las especies de HRV A y C, los subtipos más frecuentes en la clínica de diversas enfermedades pulmonares. Seleccionamos 31 péptidos que contenían posibles epítopos T CD8 y 14 péptidos que contenían posibles epítopos T CD4. Los péptidos se seleccionaron por estar altamente conservados en múltiples serotipos de HRV A y C y se predijo que se unían a varias moléculas de HLA I o II. Con respecto a los epítopos T CD8, mediante ensayos de IFNg-ELISPOT encontramos respuestas de memoria positivas a 23 péptidos conservados en células mononucleares de sangre periférica de 14 sujetos tipados para HLA I. Confirmamos la producción de IFNg por parte de los linfocitos T CD8 en respuesta a los péptidos y la unión a las moléculas de HLA I correspondientes para 6 epítopos T CD8 de HRV A y 3 de HRV C. Además, validamos los epítopos restringidos por HLA-A*02:01 mediante tinción con multímeros de HLA y descubrimos que estos péptidos mediaban citotoxicidad. Todos estos epítopos restringidos por HLA-A*02:01 tenían una longitud de 9 residuos pero, interesantemente, también validamos un epítopo T CD8 de 16 residuos. Con respecto a los 14 epítopos T CD4 candidatos, encontramos respuestas positivas de memoria mediante ensayos de IFNg-ELISPOT a 8 péptidos, validando 7 de ellos (3 de HRV A y 4 de HRV C) como epítopos T CD4 a través de ensayos de tinción de citoquinas intracelulares. Además, verificamos su unión promiscua a múltiples moléculas de HLA II mediante ensayos competitivos de unión de péptidos a moléculas de HLA. Dada la relación entre el reconocimiento del antígeno por parte de los linfocitos B y los linfocitos T CD4, también predijimos 7 epítopos B conservados en las proteínas de la superficie de la cápside de HRV y encontramos producción de IgG específica de esos péptidos por parte de linfocitos B de memoria en 5 donantes mediante ensayos de ELISPOT de IgG. De acuerdo con su perfil de unión a HLA I y II validado experimentalmente, el conjunto de estos 9 epítopos T CD8 y 7 epítopos T CD4 podría ser presentado y reconocido por más del 87 % y 98 % de la población mundial, respectivamente. De hecho, determinamos las respuestas de IFNg a pooles de péptidos que contenían estos epítopos de HRV mediante tinción de citoquinas intracelulares, encontrado respuestas T CD8 positivas en 28 de 30 donantes (93,3 %) y respuestas T CD4 positivas en 29 de 30 donantes (96,6 %). Dada la amplitud en las respuestas, los epítopos T conservados que hemos identificado podrían ser de gran interés para monitorizar las infecciones por HRV y podrían también tener utilidad terapéutica, ayudando a los individuos infectados a acabar con la infección. Estos epítopos también representan excelentes candidatos para desarrollar una vacuna efectiva frente a la mayoría de serotipos de HRV, proporcionando una amplia cobertura de protección poblacional.