Development and characterization of lipid nanocarriers as a therapeutic tool against pancreatic cancer

Zusammenfassung

El cáncer de páncreas es actualmente la séptima causa de muerte relacionada con cáncer. Las terapias que se han desarrollado hasta la fecha para tratar esta enfermedad son ineficientes, lo cual se refleja en la alta mortalidad de la enfermedad. Entre los factores que contribuyen a la agresividad y mortalidad asociadas a este tipo de cáncer encontramos la falta de sintomatología en etapas tempranas de la enfermedad y la falta de biomarcadores que permitan la detección temprana de la misma, que hacen que esta sea diagnosticada en etapas avanzadas, cuando la resección del tumor no es posible. Pero uno de los principales factores que determinan el mal pronóstico asociado al cáncer de páncreas es la existencia de células madre tumorales pancreáticas (PCSCs, de sus siglas en inglés ‘Pancreatic Cancer Stem Cells’). Estas células presentan fenotipos más desdiferenciados, capacidad de autorrenovación, capacidad para generar la progenie diferenciada del tumor y pueden presentar capacidad metastática, además de diversos mecanismos de resistencia a quimio y radioterapias. Los tratamientos actuales, por lo general, son efectivos matando a las células diferenciadas y replicativas, que conforman la mayor parte del tumor pero no son efectivas matando a las CSCs. Dadas las características de las CSCs y su papel en el desarrollo, pronóstico y agresividad del cáncer, se ha planteado que el desarrollo de terapias que vayan direccionadas específicamente hacia este tipo celular supondría una mejora considerable en los resultados terapéuticos. En este contexto, las nanopartículas (NPs) o nanotransportadores (NTs) como sistemas de liberación de fármacos se presentan como una herramienta muy interesante capaz de solventar algunos de los problemas que presentan las quimioterapias convencionales. Las NPs ofrecen ciertas ventajas como la posibilidad de encapsular y solubilizar compuestos insolubles en agua, ofrecen protección al fármaco encapsulado frente a la degradación, pueden presentar patrones de liberación controlada e incluso de liberación en respuesta a un estímulo determinado (como por ejemplo pH). Pero lo más interesante es que pueden usarse para conseguir la liberación del fármaco específicamente en el tumor mediante un mecanismo de direccionamiento pasivo, que aprovecha las condiciones anatómicas y fisiológicas alteradas en el tumor para conseguir la acumulación de NPs de tamaños entre 20 y 200 nm en el tumor, o mediante un mecanismo de direccionamiento activo. En este caso, en el diseño del NT se introducen elementos que reconozcan de forma específica receptores sobreexpresados por las células del tumor que se pretende eliminar. Por ejemplo, el ácido hialurónico (HA) se ha usado para funcionalizar NPs con el objetivo de que estas se dirijan de forma direccionada a CSCs, ya que el HA es reconocido de forma específica por el receptor CD44, que está sobreexpresado en las CSCs identificadas en tumores de páncreas, además de en CSCs de otros tipos de cáncer. El direccionamiento, pasivo o activo, supone que el fármaco se concentra en la zona objetivo, reduciendo los posibles efectos adversos derivados de la inespecificidad de las quimioterapias. Además, permitiría que la dosis de fármaco administrada fuera menor, ya que se eliminarían las pérdidas de fármaco en tejidos no objetivo. Otro aspecto interesante es que las NPs posibilitan la administración oral de fármacos ya que el incremento de la solubilidad de los compuestos que transportan se puede traducir en una mejora de su bioaccesibilidad, mientras que la protección que el NT confiere al compuesto encapsulado podría evitar la degradación prematura en el tracto digestivo. Sin embargo, las condiciones fisicoquímicas que nos encontramos en el tracto gastrointestinal (cambios de pH, alta fuerza iónica, movimientos peristálticos, digestión enzimática, compuestos interfacialmente activos) y las barreras físicas (mucus, epitelio intestinal) pueden suponer una amenaza para las NPs, por lo que el desarrollo de NTs para la administración oral de fármacos también supone un reto. Concretamente, el mucus es un factor limitante en la absorción de fármacos y NTs a través del epitelio intestinal. Esta barrera física, compuesta principalmente de mucinas (proteínas de alto peso molecular y altamente glicosiladas) y agua, presenta una estructura en forma de gel y actúa como filtro para las partículas ingeridas oralmente, que tienen que difundir a través de ese mucus para poder alcanzar la barrera epitelial intestinal y ser absorbidas. Dentro de la gran variedad de NCs que existen, en esta tesis doctoral se presentan dos tipos diferentes de transportadores lipídicos con el objetivo de evaluar su idoneidad como terapia de administración oral frente a cáncer de páncreas. En la primera parte del trabajo se presenta la caracterización de unas nanocápsulas lipídicas líquidas (LLNs, ‘Liquid Lipid Nanocapsules’) de aceite de oliva recubiertas con albúmina sérica (BSA o HSA), albúmina sérica+HA o HA. Se analizó la estabilidad coloidal de estos sistemas, su interacción con mucina y su estabilidad y patrón de liberación de Cur bajo condiciones de digestión gastrointestinal simuladas in vitro. También se estudió la adsorción de BSA, HSA, BSA+HA, HSA+HA y HA a la interfaz aceite de oliva/agua, así como la degradación y los cambios interfaciales producidos en estas capaz interfaciales como consecuencia de la acción de las enzimas gastrointestinales y sales biliares. La composición de la cubierta de las LLNs resultó ser determinante a la hora de definir el patrón de liberación de Cur de las LLNs bajo condiciones de digestión gastrointestinal in vitro y la interacción de las LLNs con mucina. La presencia de HA en la composición de la cubierta incrementaba la interacción de las LLNs con mucina y protegía a la proteína presente en la interfaz de la degradación enzimática. Las HA-BSA LLNs fueron las que mejor retuvieron la Cur durante la fase gástrica de digestión in vitro. En la segunda parte del trabajo se presentan nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs, ‘Solid Lipid Nanoparticles’) de ácido maslínico (AM). El AM es un triterpeno pentacíclico que presenta actividad antitumoral, además de otras muy diversas actividades biológicas beneficiosas para la salud. Este compuesto se encuentra en gran cantidad en las aceitunas, especialmente en la piel de las mismas, y en las hojas del olivo. El principal problema que presenta el AM es su baja bioaccesibilidad y biodisponibilidad, derivadas de su insolubilidad en agua. El trabajo desarrollado en esta tesis ha consistido en producir SLNs con un núcleo de AM estabilizado con Poloxámero 407 o Poloxámero 407 dicarboxílico. Para ello se ha realizado el aislamiento y purificación del AM a partir del hollejo, es decir, de los residuos producidos tras el proceso de la extracción del aceite de oliva. Se han producido las SLNs y se han estudiado sus características coloidales, así como su capacidad de encapsular otros compuestos hidrófobos como la Cur o el PTX, su capacidad de entrar en células tumorales, sus efectos tóxicos en líneas celulares tumorales y sanas, y sus efectos tóxicos en animales. Además, se ha funcionalizado el sistema con HA y se ha comparado la digestibilidad in vitro y absorción a través de los modelos de epitelio intestinal in vitro Caco-2 y Caco-2/HT29-MTX, este último con capacidad para producir mucus. Con la formulación en forma de SLNs se consiguió incrementar la solubilidad del MA, lo cual mejoró de forma considerable la bioaccesibilidad del compuesto tras el proceso de digestión in vitro. Además, las SLNs mejoraron la permeabilidad intestinal del AM in vitro. Las SLNs de AM mostraron tener efecto citotóxico en la línea celular de cáncer de páncreas BxPC3, tanto en la población total como en CSCs. Además, la combinación de AM con PTX mostró tener efectos sinérgicos en estas dos poblaciones celulares de BxPC3. Se desarrollaron SLNs de AM cargadas con PTX que mostraron tener el mismo efecto citotóxico que la combinación de fármacos en su forma libre. Finalmente, las SLNs de AM no dieron lugar a efectos tóxicos en ratones tras su administración oral o intravenosa, lo cual refleja la seguridad de la administración de las mismas. Los ensayos de biodistribución a ratones no permitieron confirmar in vivo la adsorción intestinal de las SLNs administradas de forma oral, pero las SLNs administradas de forma intravenosa se distribuían de forma homogénea en el animal. Este trabajo presenta dos tipos de NCs con composiciones muy diferentes que presentan comportamientos también diferentes en relación al proceso digestivo. La caracterización de estas LLNs y SLNs aporta un poco más de luz a la hora de entender la interacción de cada tipo de sistema con el medio gastrointestinal, lo cual puede ayudar al diseño racional de NTs como sistemas de administración oral de fármacos.