Characterization of cyclo-oligosaccharide-based nanoparticles as siRNA vectors

Resumo

Con el descubrimiento del ARN de interferencia, y más concretamente, del small interfering RNA (siRNA), se abrió un nuevo campo en la medicina que ofrece la posibilidad de tratar dianas terapéuticas antes inalcanzables con la farmacología clásica. Sin embargo, la aplicación de esta tecnología presenta algunos desafíos, como son la fácil degradación del siRNA o su dificultad para entrar en las células. A lo largo del tiempo, se han desarrollado varios abordajes para dar respuesta a este problema, de los cuales la nanotecnología es el enfoque más innovador y que ofrece más ventajas en comparación con métodos físicos o el uso de virus. Han sido descritos diferentes tipos de nanopartícula (NP), aunque en esta Tesis, nos centraremos en los polímeros naturales, concretamente en los sacáridos, los cuales ofrecen ventajas adicionales como biocompatibilidad y biodegradabilidad. Esta Tesis Doctoral está enfocada en la caracterización de NPs basadas en ciclo-oligosacáridos con la finalidad de identificar factores clave a tener en cuenta en el desarrollo de nuevos vectores de siRNA para transfectar células de glioma y glioblastoma. Con ese fin, este trabajo se ha organizado en dos secciones principales: La primera de ellas consiste en el estudio de los determinantes moleculares para una transfección adecuada de siRNA en células cancerosas. Para ello, se han investigado dos pares de NPs basadas en ciclo-oligosacárido, uno de ellos consistente en ciclotrehalosas (EMA 5 y EMA 6) y el otro en β-ciclodextrinas (AMC6 y AMC36). Hemos analizado la habilidad de estas NPs para unirse al siRNA, protegerlo frente RNasas, introducirse en las células, escapar de los endosomas, y liberarlo en su lugar de acción, el citosol. Tras ello, la evidencia biológica obtenida fue complementada usando modelaje molecular in silico para identificar los mecanismos subyacentes. Respecto al primer par (basado en ciclotrehalosas), se descubrió que las grandes diferencias observadas en la protección del siRNA estaban relacionadas con el área de superficie accesible al solvente (SASA) del mismo, donde valores más bajos son equivalentes a una mayor superficie de siRNA cubierta por la NP, y esto se tradujo en una mayor acción protectora frente a la degradación. Otros parámetros como la menor distancia entre los centros de masa (COM) de la NP y el siRNA, y una energía de unión más alta del complejo fueron también directamente relacionados con una protección adecuada. Por otro lado, para el segundo par (basado en β-ciclodextrinas), se encontraron grandes diferencias entre la eficiente transfección de siRNA por parte de AMC6 y la deficiente de AMC36, debidas a la energía de unión, crítica para la descomplejación, donde niveles demasiado altos dificultan la liberación del siRNA. La segunda parte se basa en el estudio de las vías de endocitosis implicadas en la entrada a la célula y en la actividad del eficiente vector de transfección de siRNA AMC6. Esto ha sido enfocado de dos maneras diferentes: usando inhibidores farmacológicos y disminuyendo específicamente los niveles de proteínas clave implicadas en cada uno de los tres principales procesos de endocitosis: endocitosis mediada por clatrina (CME), endocitosis mediada por caveolina (CVME) y macropinocitosis. Del uso de inhibidores farmacológicos de endocitosis no se pudieron sacar resultados concluyentes debido a la inespecificidad de los compuestos. Por otro lado, el bloqueo de CME disminuyendo los niveles de la cadena pesada de clatrina (CLTC), de CVME con caveolina-1 (CAV1) y de la macropinocitosis con p21-activated kinase 1 (PAK1) en células de glioblastoma T98G, arrojó luz sobre el mecanismo preferencial de entrada a la célula, sugiriendo que la macropinocitosis es la principal vía implicada. Sin embargo, este bloqueo no se tradujo en un descenso significativo en la eficiencia de transfección, sugiriendo la posibilidad de efectos compensatorios. En resumen, nuestros resultados indican que parámetros de modelaje molecular como el SASA del siRNA, las distancias de los COM entre NPs y el siRNA, y las energías de unión del complejo, pueden ser útiles indicadores para predecir el comportamiento de una NP como vector antes de que sea sintetizada. Además, el eficiente vector de transfección AMC6 complejado con siRNA se introduce en las células principalmente por macropinocitosis, pero el bloqueo de esta vía no tiene un efecto significativo en la eficiencia de transfección, probablemente porque otros mecanismos de endocitosis puedan compensarlo.