Ingeniería y función del dominio lectina de FimH en el ensamblaje de fimbrias tipo 1 de escherichia coli

Resumo

Las fimbrias tipo 1 de E. coli son filamentos proteicos delgados localizados en la superficie celular que median la adhesión al epitelio. Estos apéndices se ensamblan mediante la ruta chaperone-usher, en la que los complejos binarios entre las subunidades fimbriales y la chaperona periplásmica FimC son reconocidos por la proteína de la membrana externa FimD (el acomodador). La adhesina FimH se requiere in vivo para iniciar la polimerización de fimbrias debido a la mayor afinidad de FimD por el complejo FimC / FimH. Sin embargo, se desconoce la base del reconocimiento específico de FimH por parte de FimD. Los resultados presentados en esta Tesis revelan que residuos específicos dentro del dominio lectina N-terminal de FimH son reconocidos específicamente por FimD in vivo como un paso esencial para la biogénesis de fimbrias tipo 1. Este trabajo comenzó como parte de un proyecto biotecnológico de ingeniería de fimbrias en el que el dominio N-terminal de FimH fue sustituido por diferentes dominios tipo Ig derivados de anticuerpos. Estas construcciones quiméricas se produjeron de forma estable pero no se ensamblaron en fimbrias. Por el contrario, las fusiones N-terminales de estos dominios tipo Ig heterólogos con la adhesina FimH de longitud completa permiten su incorporación a la fimbria, lo que sugiere que el dominio lectina N-terminal se reconoce directamente durante el ensamblaje. Para demostrar ésto, se generó una colección de mutantes puntuales FimH N-terminales estables, mediante PCR mutagénica, que fueron seleccionados mediante un sistema de presentación en fagos (phage display), y se analizó su incorporación en la fimbria. Los resultados revelaron que los residuos específicos, conservados entre diferentes cepas de E. coli, dentro del dominio N-terminal de FimH se reconocen durante el ensamblaje. Estos residuos están expuestos en bucles en el dominio N-FimH, y comprenden los aminoácidos G14, G15 y G16 en el primer bucle y H45, N46 y D47 en el segundo. Proponemos un modelo en el que estos residuos de FimH son clave para la interacción con el usher FimD y, en consecuencia, para su activación. Además, hemos generado una librería de adhesinas recombinantes mediante ingeniería de secuencias específicas del dominio N-terminal de FimH en un sistema de presentación en fagos. La mutagénesis dirigida de este dominio reveló secuencias permisivas que permiten la aleatorización y consiguientemente que la proteína FimH recombinante se ensamble en la fimbria.