Detección del gen "stx2" en muestras ambientales y evaluación de su variabilidad

Resumo

Las cepas de "Escherichia coli" productoras de toxina Shiga han emergido recientemente como patógenos humanos, provocando graves enfermedades como la colitis hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico. Los principales factores de virulencia de estas cepas lo constituyen unas potentes citotoxinas conocidas como toxinas Shiga (codificadas por genes "stx" en el genoma de bacteriófagos atemperados), una proteína de membrana externa (intimina), responsable de la adhesión de la bacteria al epitelio intestinal y una enterohemolisina. La transmisión horizontal de los genes "stx" mediada por bacteriófagos, podría explicar la elevada diversidad de serotipos de "E. coli" portadores de estos genes. El objetivo de la tesis doctoral fue el análisis de la prevalencia del gen "stx2 "en ambientes acuáticos y la detección, el aislamiento y la caracterización de las bacterias portadoras del gen, así como el estudio de los bacteriófagos portadores del gen "stx2 "integrados en estas bacterias. Se diseñó un método basado en la combinación del NMP y la PCR anidada utilizando cebadores específicos para la subunidad A del gen "stx2 " para el estudio de prevalencia. Se analizaron aguas residuales crudas municipales y de mataderos. El gen "stx2 " fue detectado en todas las muestras, observándose una relación constante entre el número estimado de cepas "stx2 "estimado independientemente del origen de la muestra. Se caracterizaron 144 cepas portadoras del gen "stx2 " aisladas mediante el método de la hibridación colonial utilizando agar chromocult y una sonda específica para el gen stx2. Asímismo, se aislaron 72 cepas de "E. coli" O157 utilizando la técnica de la separación inmunomagnética, la siembra en el medio selectivo CT-SMAC y la detección inmunológica del antígeno O157. También se analizó el patrón de digestión del lipopolisacárido. Se seleccionaron un total de 65 cepas portadoras del gen "stx2 "y 28 cepas O157, como representantes. Todas las cepas fueron clasificadas como "E. coli" mediante la galería API 20E o secuenciación del 16S rDNA. Estas cepas fueron serotipadas detectándose 36 serotipos, algunos de los cuales no habían sido identificados previamente como portadores del gen "stx2 ". Posteriormente, se analizó la resistencia a diferentes antibióticos siendo las sulfonamidas, tetraciclina, cloramfenicol, trimetroprim y estreptomicina los antibióticos que presentaron mayor número de resistencias. Todas las cepas eran portadoras de una o dos de las variantes del gen "stx2 " descritas (c, d, e y g). Respecto a otros factores de virulencia se detectó el gen "stx1 "n el 28% y 20% de las cepas aisladas de agua residual urbana y agua residual de matadero bovino respectivamente. El gen "eae" fue detectado en las cepas "E. coli" O157:H7 mientras que el gen codificante para la enterohemolisina fue detectado en el 7%, 46% y el 11% de agua residual urbana, matadero bovino, y agua residual de origen mixto, respectivamente. El gen "saa" fue detectado en 5 cepas. Se detectó la producción de proteína Stx2 en algunas de las cepas aisladas, mayoritariamente aquellas de origen bovino. En el caso de la Stx1 un mayor porcentaje de cepas que expresaban el gen. La mayoría de las cepas aisladas presentaron bacteriófagos inducibles algunos de los cuales eran portadores del gen "stx2 " (mayoritariamente cepas aisladas de agua residual de matadero bovino). Los bacteriófagos portadores de distintas variantes del gen "stx2 " presentaron variabilidad en cuanto a su capacidad de infectar a diferentes cepas huésped. Además presentaron variabilidad en los patrones RFLP y sitio de integración. Estos bacteriófagos presentaron dos morfologías diferentes: cápsides icosaédricas hexagonales con colas cortas y cápsides alargadas con colas largas. La diversidad de bacteriófagos portadores del gen stx2 observada podría contribuir a la dispersión del gen "stx2 " entre las diferentes poblaciones bacterianas. ENGLISH