Estratègies d’operació per a la producció de lipases de Rhizopus oryzae amb el fenotip Mut(s) de Pichia pastoris mitjançant substrats mixtes

Resumo

En aquest treball s’ha optimitzat el procés de producció de lipases de Rhizopus oryzae amb el fenotip Muts de Pichia pastoris mitjançant la utilització de substrats mixtes establint les condicions de procés més favorables. S’utilitza un sistema de 48 milibioreactors de 12 ml de volum amb l’objectiu d’optimitzar el procés de selecció de l’estratègia de cultiu més efectiva. Quan els cultius es realitzen utilitzant els fenotips Muts i Mut+ de P. pastoris sota promotors induïbles (AOX i FLD) s’obté un creixement deficient. La principal problemàtica recau en el sistema de condensació que presenten els milibioreactors a la part superior. S’utilitza el promotor GAP utilitzant glicerol i glucosa com a substrats, amb el que es demostra la viabilitat del sistema de 48 milibioreactors pel seguiment de bioprocessos. Posteriorment davant les avantatges que presenta la utilització de substrats mixtes en soques de fenotip Muts sota el promotor AOX, s’utilitzen sorbitol o glicerol juntament amb el metanol per observar l’efecte del cosubstrat sobre la producció de ROL. A l’utilitzar el sorbitol es realitzen cultius en semicontinu mantenint la concentració de metanol fixada en 0.5, 2 i 4 g l-1 i es manté la ? fixada en 0.01 i 0.02 h-1. S’observa que la concentració de metanol residual en el medi de cultiu és el paràmetre clau per l’optimització de la producció de ROL, trobant-se els valors màxims quan aquesta es troba fixada a 2 g l-1. A l’augmentar o bé disminuir aquesta concentració, la productivitat disminueix considerablement (2 vegades). Finalment es valida un sistema SIA per a l’anàlisi de sorbitol en línia. El sorbitol es considera un cosubstrat excel·lent però presenta una baixa ?max, fent així que el procés de producció sigui menys efectiu, si es compara amb una font de carboni alternativa. S’utilitza el glicerol com a cosubstrat, el que permetrà treballar a ? 5 vegades superiors. Es realitzen cultius en semicontinu mantenint la concentració de metanol fixada en 2 g l-1 (valor optimitzat prèviament). En aquest treball es realitzen diferents cultius on la ? es manté fixada en 0.1, 0.05 i 0.02 h-1. Es conclou que per evitar la repressió del promotor AOX la relació establerta entre les ? ha de ser inferior a 6 (?Gli ?Met-1), degut que al superar aquest valor s’observa una clara repressió del promotor AOX. A continuació, es decideix realitzar el canvi d’escala de les condicions més productives. Es realitzen varis cultius utilitzant el reactor a un volum inicial de treball de 30 l. Després d’estimar un favorable canvi d’escala es reprodueixen les condicions obtingudes en el millor dels processos. Durant aquest primer cultiu s’obtenen valors de productivitat volumètrica i específica 2.8 vegades inferiors als obtinguts prèviament en 5 l. Es realitzen experiments per comprovar la mescla del metanol al reactor UD50 mostrant un gradient màxim de 0.5 gMet l-1 a les diferents alçades. Es realitza una modificació al sistema d’addició del metanol, addicionant-lo de forma submergida a mitja alçada del reactor. Posteriorment els resultats milloren en un 48%, en comparació a l’addició pel capçal del reactor. Finalment es treballa amb una construcció genètica del fenotip Muts de P. pastoris que inclou la coexpressió del gen HAC1. Es treballa amb 2 soques, la primera coexpressa el gen HAC1 de forma induïble sota el promotor AOX i la segona ho realitza de forma constitutiva sota el promotor GAP. Quan s’utilitza la soca que coexpressa el gen de forma induïble, es troben millores significatives (augment de 1.5 vegades de la productivitat) al realitzar una estratègia amb substrats mixtes (sorbitol i metanol) a les condicions prèviament optimitzades. Quan s’utilitza la soca que coexpressa el gen de forma constitutiva, no es presenten millores en el procés de producció.