New strategies for the therapeutic monitoring of immunosuppressive drugsdried blood microsampling techniques and oral fluid samples

Resumo

Los fármacos inmunosupresores son el tratamiento principal tras el trasplante de órgano sólido, siendo decisivos en la supervivencia del órgano trasplantado y del propio paciente tras el trasplante. Sin embargo, debido a su estrecho margen terapéutico y a su gran variabilidad farmacocinética inter e intrapaciente, la monitorización terapéutica de sus concentraciones (TDM) en sangre es crucial para, mediante el ajuste de las dosis, mantener las concentraciones de fármaco inmunosupresor dentro del margen terapéutico. La TDM rutinaria de los niveles de inmunosupresores se realiza en sangre (o plasma), empleando muestras obtenidas por venopunción, un procedimiento de recolección invasivo y que requiere de personal sanitario especializado para su recolección. En la presente Tesis Doctoral se han investigado dos alternativas a la venopunción, mínimamente invasivas: las técnicas de microsampling de sangre seca (en concreto, las gotas de sangre seca o DBS y las micromuestras de absorción volumétrica o VAMS) y las muestras de fluido oral. La hipótesis de partida de esta Tesis es, por tanto, que la TDM de inmunosupresores empleando muestras obtenidas por microsampling o muestras de fluido oral puede ser una alternativa fiable e incruenta a las matrices convencionales obtenidas por venopunción. Además, su aplicación hará más sencillo el control de la adherencia a los tratamientos, y la monitorización de la estrecha relación efectividad/toxicidad de estosfármacos, ahorrando asimismo muchos traslados a centros sanitarios, y contribuyendo, en definitiva, a mejorar la calidad de vida de los pacientes trasplantados. Por lo tanto, el principal objetivo de esta Tesis ha sido evaluar la utilidad de las técnicas de microsampling de sangre seca y las muestras de fluido oral como alternativas para la TDM de los principales fármacos inmunosupresores sujetos a seguimiento periódico de sus niveles en sangre (ciclosporina, everolimus, ácido micofenólico, sirolimus y tacrolimus). Para ello, se desarrollaron tres tipos de metodologías analíticas, altamente sensibles y precisas, basadas en el uso de la cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS): los métodos de referencia (en sangre venosa y plasma), las metodologías en muestras de microsampling de sangre seca (DBS y VAMS) y la metodología en muestras de fluido oral.Todas las metodologías analíticas fueron validadas en función de los requerimientos específicos de cada una de ellas. Una vez completamente validadas, las metodologías fueron aplicadas al análisis de muestras reales de pacientes trasplantados hepáticos a seguimiento en el Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela (CHUS).En el caso de las técnicas de microsampling, se realizó una validación clínica para tacrolimus y ácido micofenólico en DBS y VAMS, comparando las concentraciones obtenidas en estas muestras con las obtenidas en las matrices convencionales mediante la aplicación de los test estadísticos adecuados. Se observó una alta correlación lineal en todos los casos y, después de la transformación de las concentraciones cuando fue necesario, se cumplieron los criterios de aceptación analíticos para los dos inmunosupresores en DBS y VAMS. Además, para tacrolimus en DBS se cumplieron los altamente exigentes requerimientos clínicos. Por otro lado, no se encontró ningún impacto significativo del hematocrito en la cuantificación de ningún analito. También se comparó el rendimiento de ambos tipos de técnicas de microsampling en función de los resultados obtenidos en las validaciones analítica y clínica, la calidad de la muestra recogida y el coste de los dispositivos, obteniéndose mejores resultados para las DBS. Por último, se realizó un estudio piloto para comprobar la aplicabilidad de estas metodologías en el contexto de la población real objeto de estudio.En el caso del fluido oral, se demostró la aplicabilidad de la metodología mediante el análisis de muestras reales, detectando las bajas concentraciones de inmunosupresores presentes en esta muestra biológica, y reportando por primera vez la determinación de everolimus en fluido oral. Además, se demostró la relevancia de utilizar un colector de fluido oral adecuado para garantizar la adecuada recuperación de los analitos.