Pretratamiento de bagazo de caña de azúcar por ozonólisis para obtención de bioalcoholesefectos sobre la liberación de azúcares, la generación de inhibidores y las fermentaciones

Resumo

En las últimas décadas, el creciente aumento de la población humana asociado al desarrollo industrial ha llevado al consumo excesivo de combustibles fósiles, que han sido los responsables del incremento en las concentraciones de gases contaminantes en la atmosfera, amenazando la calidad ambiental del planeta. Este panorama ha llevado a la búsqueda de nuevas alternativas para la sustitución de los combustibles fósiles por otras reservas energéticas ambientalmente sostenibles y provenientes de fuentes renovables. Una de las opciones más prometedoras es la producción de biocombustibles líquidos para utilización como carburantes a partir de residuos abundantes como los lignocelulósicos, ricos en azúcares. Su principal ventaja es que se trata de residuos que, en vez de ser tratados como tales, pueden ser valorizados generando productos de valor añadido, pero, además, suponen una baja huella de gases del efecto invernadero. Sin embargo, su producción es compleja, y presenta retos tecnológicos que todavía deben de ser superados para llegar a procesos que sean económicamente viables. La producción de biocombustibles lignocelulósicos, en lo que se denomina combustibles de segunda generación, puede dividirse, de manera simplificada, en tres etapas principales. La primera etapa, el pretratamiento, es la clave para la obtención de buenos rendimientos, es la responsable de la desestructuración de la biomasa y la liberación de los polímeros de azúcares de su matriz con la lignina que les protege. Una vez liberados los polímeros de azúcares, la etapa siguiente, la hidrólisis enzimática, tiene por objetivo su sacarificación y producción de azúcares más pequeños que puedan ser convertidos por microorganismos en los productos de interés. En una última etapa, los hidrolizados ricos en azúcares simples son fermentados por microorganismos especializados, convirtiéndolos en biocombustibles. En esta tesis doctoral se ha estudiado la aplicación del ozono como forma de pretratamiento para producción de biocombustibles a partir de un residuo lignocelulósico muy abundante, el bagazo de caña de azúcar. Este pretratamiento, llamado ozonólisis, es un método químico oxidativo para la remoción de la lignina por degradación y/o solubilización. A pesar de haber sido poco explorado todavía, presenta características muy prometedoras. Comparándole con los pretratamientos tradicionalmente empleados, sus principales ventajas son: la no generación de furfurales o hemifurfurales, sus condiciones suaves de operación (presión y temperatura ambiente), y la ausencia de residuos intermedios, ya que el ozono utilizado se descompone durante el pretratamiento o es fácilmente destruido al final del proceso. Se ha seleccionado la configuración del pretratamiento en lecho fijo, debido a su mejor cinética, mejor aprovechamiento de la corriente de ozono, menor cantidad de reacciones secundarias y ausencia de fase líquida. Se ha utilizado como materia prima el bagazo de caña de azúcar, un residuo generado en grandes cantidades en varios países tropicales, sobre todo Brasil. Este residuo presenta características muy deseables para la aplicación como sustrato, tales como: alta disponibilidad, bajo coste, alto contenido de carbohidratos y bajo contenido de extractivos y cenizas. En el Capítulo 1 se presentan la justificación práctica de los estudios de esta tesis doctoral, asimismo los objetivos que se han planteado y su forma de desarrollarse. En el Capítulo 2 se hace un recogido por la literatura más reciente de la producción de biocombustibles, enfocándolo hacía los objetivos de esta tesis. Se presentan también su relación temática con los artículos de la tesis, la metodología que se empleó, los resultados alcanzados y las conclusiones más relevantes obtenidas. El Capítulo 3 de esta tesis, empleado a modo de presentación de antecedentes o estado del arte, es una revisión ya publicada que recoge los principales aspectos de la utilización de la ozonólisis como pretratamiento: las reacciones involucradas; la generación de compuestos inhibidores; las modificaciones estructurales y morfológicas post pretratamiento; y, los efectos de los parámetros de proceso y de la configuración del reactor empleado. El Capítulo 4 se trata del primer estudio realizado sobre la capacidad del pretratamiento por ozonólisis para aumentar la digestibilidad enzimática del bagazo de caña de azúcar. Se exploran las posibilidades de este pretratamiento para la ruptura de lignina y liberación de azúcares y se estudian el efecto de las que se consideraron las principales variables de operación: humedad del bagazo y concentración de ozono en el flujo de aire. Se observó una disminución del tiempo de reacción con el aumento de la concentración de ozono, y el efecto protector de las altas concentraciones de humedad sobre la degradación de los carbohidratos. El poder de delignificación del pretratamiento varió con las combinaciones de humedad y concentración de ozono, con su valor más alto en 66,8%, utilizando 3.44% (mol/mol) de ozono y 40% (m/m) de humedad. El pretratamiento proporcionó muy reducidos porcentajes de degradación de carbohidratos, con recuperaciones de entre 92,5% y 98,7%. Los principales compuestos inhibidores generados fueron xilitol y ácido acético, satisfactoriamente eliminados por lavado con agua. En la mejor condición de operación aplicada, la digestibilidad del bagazo aumentó de 6,64% a 41,79% para celulosa y de 2,05 a 52,44% para xilano, comparando bagazo in natura y pretratado. Para el bagazo ozonizado-lavado, estos valores fueron de un 46% para celulosa y un 28% para xilano. El aumento en la digestibilidad de la celulosa con el lavado ha sido atribuido a la remoción de compuestos que estarían generando impedimento estérico a las enzimas, mientras que la disminución en el xilano ha sido debido a su lixiviación en el agua del lavado. Con el objetivo de realizar un estudio sistemático y optimizar las variables de operación, se realizó un estudio estadístico aplicando un diseño experimental con una matriz ortogonal L9(3)4. Los resultados de este primer estudio estadístico están descritos en Capítulo 5, dónde se ha analizado la influencia de los parámetros: humedad, concentración de ozono, flujo de ozono/oxígeno y tamaño de partícula. Los resultados revelaron que la concentración de ozono es el parámetro más importante del pretratamiento para la liberación de azúcares, obteniéndose rendimientos máximos para concentraciones de ozono de 2% (mol/mol). Por otro lado, en cuanto al consumo de ozono, la humedad es el factor más influyente en la producción de azúcares por gramo de ozono gastado en el pretratamiento. La optimización de las condiciones de operación resultó en una combinación similar a la de uno de los experimentos ensayados, donde se obtuvieron un 77,55% y un 56,95% de conversión de celulosa y de xilano, respectivamente. La fermentación de los hidrolizados por la levadura Saccharomyces cerevisiae bakery proporcionó rendimientos de entre 80% y 88% respecto al máximo teórico, y el ANOVA de los resultados demostró ausencia de efecto inhibidor. Por otro lado, la levadura Pichia stipitis DSM 3651 fue completamente inhibida, no siendo capaz de crecer en ningún de los hidrolizados. Estudios preliminares de balance energético entre el ozono gastado y el etanol producido pusieron de manifiesto la necesidad del aprovechamiento de la fracción xilosa. El estudio del Capítulo 6 se centra en la producción de inhibidores durante el pretratamiento, y aplica una etapa de detoxificación, mediante lavado con agua, entre el pretratamiento y la hidrólisis enzimática. Este trabajo ha permitido evaluar los efectos de los parámetros de operación sobre la producción de inhibidores, el tipo y concentración de los subproductos generados, el efecto del lavado en la solubilización de la biomasa pretratada y la fermentabilidad de los hidrolizados obtenidos para obtener etanol empleando Pichia stipitis y butanol con dos tipos de Clostridium. El proceso de lavado supuso unas pérdidas de materia del bagazo ozonizado de hasta un 30%, debido en gran parte a la lixiviación del xilano y la remoción de los compuestos de degradación de la lignina. Estas pérdidas presentaron relación directa con la cantidad de ozono gastado en el pretratamiento, que afectaron principalmente a la composición de xilano y lignina ácida insoluble. Los rendimientos de conversión de los polímeros de azúcares también se relacionaron directamente con la cantidad de ozono gastado, con ambos aumentando en el mismo sentido. El análisis de la matriz ortogonal demostró que el ozono y humedad son los factores más importante en la delignificación del bagazo, con sus óptimos en un 2% (mol/mol) y 45% (m/m), respectivamente. En términos de conversión de azúcares, la concentración de ozono fue el parámetro más importante, con su óptimo en un 2% (mol/mol). Por otro lado, la humedad fue el factor determinante en la generación de inhibidores, con mayor generación de compuestos fenólicos para bajas humedades y mayor formación de ácidos orgánicos para humedades intermedias (con su máximo en 45%, m/m). El proceso de detoxificación por lavado resultó bastante eficiente, removiendo completamente el ácido fórmico, y hasta un 97%, 82% y 77% de ácido oxálico, ácido acético y compuestos fenólicos, respectivamente. Los inhibidores remanentes en los hidrolizados no afectaron a los microorganismos utilizados para producción de etanol, Pichia stipitis DSM 3651, y butanol, Clostridium acetobutylicum DSM792 y Clostridium beijerinckii DSM6422. Se observó, sin embargo, una relación directa entre la cantidad de azúcar inicial en las fermentaciones y los productos obtenidos, con los rendimientos aumentando con el incremento de la concentración de azúcares iniciales. Para P. stipitis se alcanzó hasta un 88% de rendimiento de etanol máximo teórico, mientras que para C. acetobutylicum los productos alcanzaron valores de 0,072 gBUTANOL/gAZÚCAR y 0,188 gABE/gAZÚCAR, y, para C. beijerinckii 0,165 gBUTANOL/gAZÚCAR y 0,257 gABE/gAZÚCAR. El balance energético para etanol fue favorable, con 1,03 MJ de energía neta generada por kg de bagazo pretratado y fermentado. En cuanto a las fermentaciones para producción de butanol, el balance energético fue negativo para las dos bacterias testadas, resultando un mayor gasto de energía en la producción del ozono que lo obtenido en la combustión teórica de los biocombustibles producidos. En el Capítulo 7 se presenta un estudio desarrollado en colaboración con el Laboratorio de Enzimas Microbianas del Instituto de Química de la Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, campus de Araraquara, Estado de São Paulo, Brasil. En ese trabajo, se evaluó la aplicación de enzimas fúngicas a la hidrólisis del bagazo ozonizado, comparándolas con las enzimas comerciales tradicionalmente empleadas. Para ello se utilizó un hongo termófilo, Myceliophtora thermophila JCP 1-4, aislado en pilas de bagazo de caña de azúcar de factorías de producción de azúcar y alcohol. Las enzimas fúngicas, en hidrólisis a 50 ºC, demostraron resultados ligeramente mejores que las enzimas comerciales. También se encontró en este hongo una característica poco documentada, la capacidad de producir glucosa isomerasa, convirtiendo parte de la glucosa de los hidrolizados en fructosa. Las enzimas producidas presentaron también buenas características térmicas, con la mejor cinética de producción de glucosa a 60 ºC y 8h de tiempo de hidrólisis. El monitoreo de la actividad enzimática durante las sacarificación del bagazo ozonizado puso de manifiesto, además, que el bagazo ozonizado induce la actividad de las enzimas fúngicas, aumentándola con el tiempo de reacción. Cuando se optimizó la cantidad de FPU por gramo de celulosa, se encontraron los mejores rendimientos de glucosa en 7,5, valor ligeramente más bajo que los convencionalmente utilizados en trabajos para hidrólisis de materiales lignocelulósicos pretratados. Con el objetivo de hidrolizar bagazo en mayores concentraciones, las enzimas producidas fueron concentradas por rota vapor. Si por un lado las enzimas presentaron buena resistencia al proceso de concentración, por otro se encontró un ligero efecto inhibidor trabajando con mayores cargas de materia seca en las hidrólisis, probablemente debido a la inhibición de la β-glucosidasa. Los mejores hidrolizados obtenidos fueron fermentados por Saccharomyces cerevisiae bakery para producción de etanol, con rendimientos alrededor del 60% del máximo teórico.