Análisis del nivel de ploidía y estructura genética de gametos de mandarino

Resumo

En esta tesis, se ha utilizado por primera vez la citometría de flujo para determinar el nivel de ploidía de poblaciones de granos de polen de diferentes especies diploides y euploides de cítricos, y se combinó con la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y la amplificación del genoma completo (WGA) para la individualización de núcleos de granos de polen y posterior análisis con múltiples marcadores moleculares. Mediante citometría de flujo y microscopía óptica se diferenciaron los tipos de núcleos presentes en los granos de polen de genotipos diploides y euploides analizados, y se demostró que los cítricos tienen polen binuclear. En el tangor `CSO¿ se identificó una población de núcleos adicional compuesta por los núcleos vegetativos y generativos. El análisis con marcadores SNP y SSR de las poblaciones de núcleos, vegetativos, generativos y de esta tercera población adicional reveló que las tres poblaciones de núcleos presentan la misma configuración genética. Se demostró la presencia de gametos no reducidos en el genotipo diploide de lima `Mexicana¿. Se comprobó que la WGA de núcleos individualizados es un método robusto para el genotipado de núcleos haploides con múltiples marcadores moleculares, mientras que el análisis con marcadores heterocigotos de las amplificaciones de núcleos diploides mostró un sesgo hacia uno de los dos alelos, lo que impide el uso de esta metodología para el análisis de este tipo de núcleos. La puesta a punto de la metodología combinada de FACS y WGA en núcleos haploides nos permitió estudiar por primera vez eventos de recombinación (CO) y distorsiones en la segregación (SD) en núcleos de granos de polen haploides. El análisis de los CO se realizó en el cromosoma 1 del limón `Eureka¿, revelando la presencia de hasta 5 CO en un brazo y 4 en el otro, con un promedio 1,97 puntos de recombinación por gameto. La SD se analizó en una población de núcleos de granos de polen individualizados del tangor `CSO¿ y una población de híbridos (`RTSO¿) que se obtuvo a partir del cruzamiento entre el tangor `RTO¿ como parental femenino y el tangor `CSO¿ como parental masculino. La SD obtenida en los núcleos de granos de polen del tangor `CSO¿ fue menor (13.8%) respecto a la observada en la población de plantas `RTSO¿ (20.7%). Ambas poblaciones mostraron SD sincronizada en el grupo de ligamiento (GL) 2, mientras que el GL 7 solo mostró una SD en la población de plantas `RTSO¿. Se distinguieron mecanismos de selección gametofítica masculina en la población de núcleos de granos de polen, mientras que en la población de plantas se observaron mecanismos de selección gametofítica y/o selección zigótica. Estos resultados demuestran que esta metodología es eficiente para realizar estudios genéticos con un gran número de marcadores moleculares sin la necesidad de regenerar poblaciones. La obtención de dos poblaciones de híbridos triploides con el mandarino `Moncada¿ tetraploide en hibridaciones 2x x 4x y 4x x 2x nos ha permitido estudiar los modelos de segregación cromosómica a nivel masculino y femenino de un mismo genotipo. El mandarino `Moncada¿ tetraploide como parental femenino y masculino mostró mayoritariamente un modelo de segregación tetrasómico. Sin embargo, como parental femenino en el GL8 se observó un modelo de herencia intermedia con tendencia hacia la tetrasomía, mientras que el GL4 mostró una clara herencia intermedia. Como parental masculino, los GLs 5 y 6 que presentaron modelos de segregación intermedios. Estas variaciones en el modo de segregación a nivel de GL según la dirección de las hibridaciones tienen importantes implicaciones en los programas de mejora genética. Además, se observaron valores significativos de doble reducción (DR) en cinco GLs como parental femenino y en seis GLs como parental masculino. Se discuten la importancia y las aplicaciones de los resultados en los programas de mejora genética de mandarino.