Comunicación bacterianafundamentos y estrategias de interferencia

Zusammenfassung

El término quorum sensing (QS) engloba una serie de mecanismos de regulación de fenotipos bacterianos mediados por la detección de moléculas señal, los cuales dan lugar a comportamientos multicelulares coordinados entre los que destacan procesos de virulencia y formación de biopelículas, entre muchos otros. En un contexto de emergencia global de resistencias a los agentes antimicrobianos clásicos, el conocimiento fundamental de los procesos de comunicación bacteriana dependientes de QS es crucial para desarrollar nuevos agentes de control frente a bacterias patógenas y oportunistas. En la búsqueda de agentes para la interferencia con el quorum — estrategia conocida como quorum quenching (QQ) —, el quitosano (CS) está ganando terreno. En concreto, las nanopartículas (NPs) a base de CS ofrecen una serie de cualidades fisicoquímicas y biológicas que las hacen especialmente adecuadas para el control microbiano y la interferencia con el QS, considerada esta última dentro de las estrategias antimicrobianas de nueva generación. Entre las propiedades de las NPs de CS destacan, además, su baja toxicidad y bioadhesividad, así como su gran versatilidad para incorporar ligandos multifuncionales o capacidad para asociar moléculas activas, incluyendo agentes de QQ. Sin embargo, las propiedades de QQ intrínsecas a las NPs de CS no se conocen a fondo. Teniendo esto en cuenta, en esta tesis se plantea la hipótesis de que las características estructurales de las NPs de CS pueden afectar drásticamente su comportamiento en la interfase NP-bacteria, determinando la bioactividad desplegada por las mismas, concretamente en el contexto del QQ. En base a esta premisa, se presentan dos estrategias de fabricación de nanopartículas de quitosano con ultraestructura y características fisicoquímicas específicas, a partir de su entrecruzamiento iónico y co-entrecruzamiento iónico/covalente, y se explora su capacidad de interferencia con el QS. Para caracterizar la actividad de las nanopartículas, se utilizó un biosensor fluorescente y altamente sensible basado en Escherichia coli, portador de un sistema de regulación de QS dependiente del regulador LuxR. Este biosensor permite la cuantificación de la respuesta de QS dependiente de la inducción por medio de acil-homoserín lactona (AHL) exógena, así como la caracterización precisa de las perturbaciones sobre el mecanismo de regulación. Durante la optimización y caracterización del biosensor se descubrió que la respuesta inducida seguía una cinética acorde con una transición de fase, concretamente de percolación, similar a la que opera en otros fenómenos críticos en la naturaleza. En base a estas observaciones, una parte importante de la tesis se ha centrado en explicar el mecanismo de QS basado en LuxR bajo el marco teórico de un modelo de percolación. Este enfoque ha permitido desentrañar, combinando ensayos microbiológicos y simulaciones in silico, algunas características fundamentales del mecanismo de regulación dependiente de LuxR y AHL, con importantes implicaciones en el diseño de estrategias de interferencia con el QS. En concreto, estos estudios han derivado en la propuesta de un mecanismo teórico novedoso para la inactivación de los complejos LuxR-AHL, el cual podría traducirse en el desarrollo de estrategias dirigidas a interacciones precisas entre los reguladores de QS y los agentes inhibidores. El conocimiento generado con el biosensor se utilizó para interpretar los resultados de QQ obtenidos con las NPs de CS generadas en este trabajo. Un hallazgo central de esta tesis es la capacidad de interacción de las NPs de CS con las células del biosensor, en un mecanismo co-dependiente de la densidad bacteriana y de la dosis de nanopartículas. Este mecanismo es consistente con la existencia de una relación estequiométrica NP/bacteria, la cual se establece de forma natural durante el crecimiento bacteriano. El trabajo de esta tesis abre nuevas puertas al desarrollo de agentes antimicrobianos de nueva generación basados en nanomateriales, con capacidad para perturbar el QS y reducir así la virulencia bacteriana. Además, se plantea este trabajo como base de esfuerzos futuros encaminados al desarrollo de nanomateriales a base de CS con capacidad para interferir, de forma dirigida, con los mecanismos de virulencia de bacterias patogénicas en momentos específicos del crecimiento bacteriano, así como para incorporar y liberar moléculas activas en contextos donde la interferencia con los mecanismos naturales de agregación bacteriana puede ser particularmente relevante, como en heridas e infecciones crónicas pulmonares.