Molecular basis of chemosensory, biofilm and cell-to-cell signallingin different species of pseudomonas

Resumo

Molecular basis of chemosensory, biofilm and cell–to-cell signaling in different species of Pseudomonas. ABSTRACT: Research described in this dissertation focuses on three important aspects of Pseudomonas signaling: Chemosensory pathways involved in chemotaxis or with alternative cellular functions (ACF), biofilm formation and bacterial communication via quorum sensing (QS). Bacteria use diverse small molecules for signaling and monitoring their levels provides valuable information on their environment as well as their intracellular status. This capacity in turn enables the bacterium to rapidly adapt to changes. While it is well established that one- and two-component regulatory systems (OCS and TCS) participate in regulating biofilm formation, there also exists evidence suggesting that chemosensory pathways are also involved. However, little information exists about which methyl-accepting proteins (MCP) and signals modulate this process. A major objective of this thesis was to cast light in to this issue. In the first part of this thesis I have generated a significant number of bacterial mutants and have then submitted the full set of all mutants in single Mcp genes to different analyses. These studies have led to the identification four mutants with significantly altered biofilm phenotypes, namely a WspA homologue of P. aeruginosa, previously identified to control biofilm formation by regulating cyclic diguanylate (c-di-GMP) levels as well as three uncharacterized MCPs. Subsequent experiments with recombinant ligand binding domains (LBD) have permitted the function annotation of two of the uncharacterized receptors. The MCP that we termed McpU was found to mediate chemotaxis towards different polyamines. The functional annotation of McpU was initiated by high-throughput thermal shift assays of the receptor LBD. Isothermal titration calorimetry (ITC) showed that McpU-LBD specifically binds the polyamines putrescine, cadaverine and spermidine, which corresponds to a MCP with a novel chemoeffector profile. I was able to establish that the MCP that we termed McpA binds specifically 12 different proteinogenic amino acids and mediates chemotaxis towards these compounds. By experimentation with corn plants I was able to show that mutants in McpU and WspA-Pp have a significantly reduced ability to colonize plant roots. Data agree with other reports showing that polyamines are signal molecules involved in the regulation of bacteria-plant communication and biofilm formation. One major role of bacterial extracellular small-molecule signaling is the cell-cell communication (QS), which involves the production, release, and community-wide detection of molecules called autoinducers. QS systems are essential for bacterial communication and proliferation. There are two principal QS systems in P. aeruginosa termed LasI/LasR and RhlI/RhlR. In the second part of the thesis, I overexpressed and purified the RhlR and LasR regulators of P. aeruginosa from lysates of E. coli grown in the absence of added acyl-homoserine lactone (AHL) signals. The subsequent analysis of both proteins by a series of techniques provided interesting insight into their function. Microcalorimetric binding studies show that both proteins recognize different AHLs with 1 AHL:1 protein monomer stoichiometry and an affinity of approximately 1 μM. Both proteins did not preferentially bind the AHLs produced by their cognate AHL synthases (RhlI y LasI). LasR and RhlR unfold at Tm values of 63 and 70 °C, respectively and AHL binding did not cause significant Tm shifts. Both proteins are present in a monomer - dimer equilibrium and AHL binding did not alter their oligomeric state. Electrophoretic mobility shift assays demonstrate that purified LasR and RhlR are able to bind to a target promoter. Significant differences in the RhlR mediated stimulation of in vitro transcription were observed in the presence of different AHLs. In conclusion, data thus show that both proteins are active and stable in the absence of bound AHL and that they are able to bind AHL ligands in a reversible manner, revising initial concepts of this protein family. With a view to the future, the availability of AHL-free protein will permit further studies to determine more precisely their mode of action. To facilitate the establishment of infection, P. aeruginosa produces an impressive array of both cell-associated and extracellular virulence factors. Several of these virulence factors have been demonstrated to be regulated by QS. Plants were found to synthesize compounds that interfere with QS either by its stimulation or quenching. However, little information is available as to the molecular identity of these compounds. The interference with the QS system of pathogens represents an alternative strategy to reduce their virulence. In the final part of the thesis, I identified rosmarinic acid (RA) as a plant-derived compound that mimics bacterial AHLs. I have showed that RA bound to RhlR with higher affinity than its cognate N-butanoyl-homoserine lactone (C4-AHL). I have observed that RA causes larger increases in RhlR mediated transcription than C4-AHL. I was able to show that RA stimulates expression from different promoters that were previously shown to by RhlR dependent. Lastly, I demonstrated that the presence of RA causes induction of typical virulence associated and QS dependent phenotypes such as increases in the production of the virulence factors pyocyanin and elastase or an enhancement of biofilm formation. Because P. aeruginosa infection induces RA secretion from plant roots, our results indicate that RA secretion is a plant defense mechanism to stimulate a premature QS response. P. aeruginosa is a ubiquitous pathogen that infects plants and animals and in this context the identification of RA as an inducer of premature QS responses may be of use to define antibacterial strategies. RESUMEN: La investigación descrita en esta tesis se centra en tres aspectos importantes de la señalización en Pseudomonas, como son: Las vías quimiosensoras involucradas en quimiotaxis o en funciones celulares alternativas, la formación de biopelículas y la comunicación bacteriana a través de sistemas de quorum sensing. Las bacterias utilizan diversas moléculas de pequeño peso molecular para monitorear su entorno, así como su estado intracelular. Esta capacidad, a su vez permite a las bacterias adaptarse rápidamente a los cambios. Aunque está bien establecido que los sistemas de regulación basados en uno y dos componentes participan en la regulación de la formación de biopelículas, también existe evidencia que sugiere que las vías quimiosensoras están involucradas en dicha regulación. Sin embargo, existe poca información sobre qué quimiorreceptores de la vía quimiosensora y cuales señales modulan este proceso. Por lo tanto, uno de los objetivos principales de esta tesis era investigar el papel que tienen los quimiorreceptores en la formación de biopelículas. Para esto, en la primera parte de esta tesis se generó un importante número de mutantes bacterianos en los quimiorreceptores de P. putida KT2440 con el fin de generar un biblioteca de 27 mutantes individuales en cada uno de los genes que codifican para un quimiorreceptor. Esta biblioteca de 27 mutantes individuales fue sometida a diferentes análisis. Los resultados de estos estudios han llevado a la identificación cuatro mutantes con fenotipos alterados significativamente en la formación de biopelículas, es decir, se identificó un homólogo del quimiorreceptor WspA de P. aeruginosa, previamente descrito como un regulador de la formación de biopelículas mediante la modulación de niveles intracelulares de diguanilato cíclico (c-di-GMP), así como de tres quimiorreceptores no caracterizados. Experimentos posteriores con proteínas recombinantes de los dominios de unión de ligando (LBD por sus siglas en ingles) de los quimiorreceptores han permitido la anotación funcional de dos de estos quimiorreceptores no caracterizados. Se determinó que el quimiorreceptor que hemos llamado McpU, regula la quimiotaxis hacia diferentes poliaminas. La anotación funcional de McpU fue llevada a cabo con ensayos de alto rendimiento de tipo “high-throughput thermal shift assays”, usando el LBD del quimiorreceptor para dichos ensayos. Por su parte, experimentos confirmatorios de calorimetría de titulación isotérmica (ITC por sus siglas en inglés) mostraron que McpU-LBD se une específicamente las poliamidas putrescina, cadaverina y espermidina, lo cual determina que McpU es un nuevo quimiorreceptor con un novedoso perfil de quimioefectores. De igual manera, se tuvo la oportunidad de establecer que el quimiorreceptor que hemos llamado McpA se une específicamente a 12 aminoácidos proteinogénicos diferentes y media la quimiotaxis hacia estos compuestos. Finalmente, en experimentos en los que fueron usadas plantas de maíz como modelo, se demostró que los mutantes McpU y WspA-Pp tienen una capacidad reducida de colonizar las raíces de las plantas cuando se encuentra en competición. Estos datos concuerdan con otros informes que muestran que las poliaminas son moléculas de señalización implicadas en la regulación de la comunicación entre bacterias y plantas, y la formación de biopelículas. Una de las principales funciones de la señalización extracelular bacteriana en las que se usa moléculas de pequeño peso molecular, es la comunicación de célula a célula de tipo quorum sensing; la cual consiste en la producción, liberación, y la detección de moléculas llamadas autoinductores (acil-homoserina lactona). Los sistemas de quorum sensing son esenciales para la comunicación y proliferación bacteriana. Existen dos sistemas principales de quorum sensing en P. aeruginosa denominados LasI/LasR y RhlI/RhlR. En la segunda parte de la tesis, se sobreexpresaron y purificaron los reguladores RhlR y LasR de P. aeruginosa a partir de lisados de E. coli cultivadas en ausencia de señales añadidas de tipo acil-homoserina lactona (AHL). El análisis posterior de ambas proteínas por una serie de técnicas biofísicas, proporcionó una interesante visión de su función. Estudios de interacción basados en microcalorimétria muestran que ambas proteínas reconocen diferentes AHLs con una estequiometria 1:1 entre un monómero de proteína y una molécula de AHL con una afinidad de aproximadamente 1 µM. Impactantemente, ambas proteínas no se unen preferentemente a las AHL producidos por sus AHL sintasas (RhlI y LasI) afines. Se determinó que estos reguladores son termoresistentes en ausencia de AHL, observándose que LasR y RhlR se despliegan a una Tm de 63 y 70 °C, respectivamente, y la unión a AHL no causa cambios significativos en la Tm. Ambas proteínas están presentes en un equilibrio monómero-dímero y la adición AHL no altera su estado oligomérica. Ensayos de movilidad electroforética demuestran que las proteínas recombinantes LasR y RhlR son capaces de unirse a un promotor diana (con caja lux en su secuencia). Funcionalmente, se observaron diferencias significativas en la estimulación de la transcripción in vitro mediada por RhlR en presencia de diferentes AHLs. En conclusión, los datos muestran que ambas proteínas son activas y estables en ausencia de AHL y que son capaces de unirse a las AHL de una manera reversible, lo cual muestra discrepancias con los conceptos iniciales formulados para esta familia de proteínas. Con miras al futuro, la disponibilidad de proteínas (LasR y RhlR) libres de AHL permitirá realizar más estudios, con el fin de determinar con mayor precisión su modo de acción. Para facilitar su establecimiento durante la infección P. aeruginosa produce una impresionante variedad de factores de virulencia extracelulares y asociados a la célula. Varios de estos factores de virulencia se ha demostrado que están regulados por densidad celular a través de sistemas de quorum sensing. Por otra parte, se han identificado plantas que sintetizan compuestos que interfieren con la comunicación bacteriana tipo quorum sensing, ya sea por su estimulación o bloqueo. Sin embargo, hay poca información disponible sobre la identidad molecular de estos compuestos. La interferencia con el sistema de quorum sensing de algunos patógenos representa una estrategia alternativa para reducir su virulencia. En la parte final de la tesis, se identificó al ácido rosmarínico como un compuesto de origen vegetal que imita a las AHL bacterianas. Se ha mostrado que el ácido rosmarínico se una al regulador RhlR con mayor afinidad que su señal natural la N-butanoil-homoserina lactona (C4-AHL). Se cuantificó que el ácido rosmarínico aumenta en mayor intensidad la transcripción mediada por RhlR que C4-AHL. Se demostró que el ácido rosmarínico estimula la expresión de diferentes promotores dependientes de RhlR. Por último, observó que la presencia del ácido rosmarínico provoca la inducción de los factores de virulencia y los fenotipos regulados por quorum sensing vía RhlR, como son: el aumento en la producción de piocianina y elastasa, o el incremento en la formación de biopelículas. Debido a que la infección por P. aeruginosa induce la secreción del ácido rosmarínico a partir de las raíces de las plantas, nuestros resultados indican que la secreción del ácido rosmarínico es un mecanismo de defensa de la planta con el cual estimula la respuesta prematura del sistema de quorum sensing. P. aeruginosa es un patógeno ubicuo que infecta a las plantas y animales y, en este contexto, la identificación del ácido rosmarínico como un inductor de respuestas prematuras de comunicación bacteriana por quorum sensing puede ser de utilidad para definir estrategias antibacterianas.