Inmovilización y aplicación de la lipasa versátil de Ophiostoma piceae en la síntesis de aromas, nutraceúticos y biodiesel

Resumo

La lipasa versátil producida por el ascomiceto Ophiostoma piceae y su forma recombinante expresada en Pichia pastoris (OPEr) son catalizadores con gran potencial biotecnológico y han sido caracterizadas exhaustivamente. No obstante, la lipasa recombinante se produce en mayor cantidad y en menos tiempo, y es más activa que la nativa. En esta Tesis se ha inmovilizado OPEr mediante distintos métodos, se han caracterizado las preparaciones obtenidas, y se ha comparado su estabilidad, eficiencia y reciclabilidad en la síntesis de varios ésteres de relevancia industrial (aromas, biodiesel y ésteres de esterol) a temperatura ambiente. La obtención de un biocatalizador inmovilizado puede ser crucial para la viabilidad de un proceso industrial, ya que contribuye a reducir sus costes al permitir el reúso de la enzima, y facilita la recuperación de los productos, evitando pasos de purificación. La lipasa se fijó sobre tres soportes sólidos insolubles, magnetita (MNP) y dos óxidos de Zn/Mn no magnéticos procedentes del reciclado de pilas (G1 y G4). OPEr se unió covalentemente por diferentes regiones: por su grupo amino terminal (a soportes funcionalizados con glutaraldehído, -GA), por sus cadenas glucídicas, tras oxidarlas para generar aldehídos (-CH, a soportes amino-funcionalizados), o formando agregados entrecruzados químicamente sobre magnetita (mCLEAs). También se inmovilizó OPEr por hidrofobicidad sobre un soporte magnético comercial con grupos octilo (SiMAG-Octyl®). Así, se obtuvieron ocho catalizadores con distinta estabilidad, eficiencia y reciclabilidad. Su estabilidad a pH y temperatura fue superior a la de la enzima libre, y su actividad se mantuvo tras almacenarla a 4 ºC durante 6 meses. Con fines comparativos, se inmovilizaron covalentemente las lipasas CalA®, CalB® y Eversa® sobre los soportes con grupos aldehído o amino. En primer lugar, se ensayó la esterificación directa de los ácidos butírico, valérico, hexanoico, heptanoico, isobutírico e isovalérico con 1-butanol (ácido:alcohol 1:2). Todas las preparaciones de OPEr sintetizaron los ésteres esperados, pero los rendimientos con AMNP-GA-OPEr superaron o igualaron los de OPEr libre y los restantes catalizadores durante 7 ciclos. En la síntesis enzimática de biodiesel se analizó la eficiencia de OPEr, Eversa®, CalA® y CalB®, en reacciones sin disolvente, a partir de aceite de cocina usado y metanol (1:4). Varias preparaciones con OPEr inmovilizada produjeron rendimientos de síntesis comparables a los obtenidos con Eversa® y mantuvieron su actividad tras 9 ciclos. El proceso catalizado por AMNP-CH-OPEr se escaló 50 veces y la eficacia fue superior en estas condiciones. La síntesis de ésteres de fitoesteroles con OPEr inmovilizada mediante transesterificación de oleato de metilo y sitostanol aumentó paulatinamente hasta alcanzar rendimientos altos en el tercer ciclo, manteniéndose en los usos sucesivos. Vista su eficiencia, se ensayó un bioproceso más sostenible, utilizando como sustratos aceite de cocina usado, metanol y el estanol, y encadenando dos reacciones mediadas por un solo catalizador (AMNP-CH-OPEr): a) metanolisis del aceite para sintetizar ésteres metílicos y b) adición del sitoestanol y producción de sus ésteres. El rendimiento fue superior al obtenido con oleato de metilo comercial durante 5 ciclos. En resumen, OPEr ha sido inmovilizada por interacción hidrofóbica, por acoplamiento covalente, y como mCLEAs. Se han validado dos nuevos materiales sostenibles para su empleo como soportes (G1 y G4), y se ha comprobado la eficiencia de la inmovilización de varias glicoproteínas a través de los aldehídos generados en sus cadenas glucídicas, un método poco conocido que estabiliza la estructura y preserva la actividad. Se ha demostrado que la síntesis de ésteres butílicos de VFAs, biodiesel y ésteres de sitoestanol catalizada por OPEr inmovilizada es viable y eficiente, y que la enzima puede reciclarse, por lo que es adecuada para su uso en bioprocesos.