Phylogenomics of bacteriodetes; halophilic bacteriodetes as an example on how their genomes interact with the enviroment

Resumo

L'ús de marcadors ribosòmics en sistemàtica bacteriana va relacionar íntimament els grups Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides malgrat el seu fenotip els classificava de manera independent. Davant l'evidència filogenètica els van agrupar al fílum Bacteroidetes, tot i que es continuen estudiant principalment per separat perquè no sembla existir una coherència fenotípica entre ells. Els fenotips que recurrentment s'atribueixen als Bacteroidetes són la descomposició de matèria orgànica complexa, la motilitat per lliscament i la pigmentació per flexirrubines i carotenoides. El recent apogeu de mètodes independents de cultiu i el desenvolupament de les tècniques de seqüenciació de polinucleòtids, ha delatat la prevalença dels Bacteroidetes a molts ecosistemes rellevants. Per exemple, certs ambients salins que aparentment seleccionen a aquests bacteris per sobre els d'altres fílums. Aquesta tesi doctoral té els objectius de (1) revisar la taxonomia dels Bacteroidetes, (2) trobar els gens codificants que puguin manifestar un fenotip identitari i (3) descobrir quins gens són seleccionats a ambients salins. Per a la revisió taxonòmica del fílum no només s'ha actualitzat la filogènia basada al gen ADNr 16S, sinó també la de l'ADNr 23S, nucleòtids signatura de la seqüència ARNr 16S, patrons d'inserció i deleció a dues proteïnes i una filogènia mitjançant el anàlisis multilocus de 29 gens. Aquesta nova taxonomia, a més de permetre la denominació d'un nou fílum, tres classes, tres ordres, vuit famílies i un gènere (tots ells vigents a la nomenclatura bacteriana), ha facilitat la filogenòmica precisa dels Bacteroidetes, que a estudis anteriors han inclòs als membres del nou fílum Rhodothermaeota. Malgrat i tot, això va minvar les possibilitats de trobar gens seleccionats per la salinitat, ja que la major part d'halòfils extrems pertanyen a aquest nou fílum. Mitjançant la comparació genòmica de 89 genomes de Bacteroidetes acuradament seleccionats es descobrí que el gens més conservats al fílum (al 90% dels genomes), presumiblement no constitutius, són els codificants del sistema de secreció tipus IX, fins ara només descrits a aquest fílum. Aquest sistema de secreció està relacionat amb el moviment per lliscament d'alguns Bacteroidetes, però també és un sistema excretor d'enzims hidrolítics. A continuació, els gens constitutius codificants del súper complex respiratori Complex Alternatiu III – citocrom caa3 oxidoreductasa al 83% dels genomes, a tots els organismes aerobis. El llinatge anaeròbic dels Bacteroidales pot completar la respiració aeròbia gràcies a un citocrom bd oxidoreductasa amb alta afinitat per l'oxigen que els ajuda a eliminar-lo de l'ambient. El complex II, succinat deshidrogenasa, de la cadena respiratòria és de còpia única a tots els genomes de Bacteroidetes i als Bacteroidales existeixen vestigis d'altres gens d'enzims del cicle dels àcids tricarboxílics que evidencien el seu passat aerobi. Finalment, els gens del Complex I de la cadena respiratòria no segueixen un patró filogenòmic als Bacteroidetes. Aquests gens són substituïts pels d'un complex I alternatiu que bomba sodi a l'espai intermembranós en lloc de protons, la NADH:quinona oxidoreductasa que bombeja sodi (Na+-NQR), només a organismes marins o de la microbiota del conducte gàstric. A més, hem trobat evidències que el complex va ser inventat pels Bacteroidetes i s'hi ha transmès horitzontalment dins ambients salins. L'expressió en conjunt del sistema de secreció tipus IX i la cadena respiratòria dels Bacteroidetes, adaptada a cadascun dels ambients que habiten, és molt probablement responsable de la radiació adaptativa del Bacteroidetes. Alguns d'aquests gens es transfereixen horitzontalment, però en conjunt prediuen que el bacteroidete original va ser un aerobi heteròtrof de matèria orgànica complexa que possiblement vivia dins aigua dolça. RESUMEN El uso de marcadores ribosomales en sistemática bacteriana relacionó íntimamente los grupos Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides pese a que su fenotipo los clasificaba de manera independiente. Ante la evidencia filogenética se agruparon en el filo Bacteroidetes, pero se siguen estudiando principalmente por separado dado que no parece existir una coherencia fenotípica entre ellos. Los fenotipos más recurrentemente atribuidos a Bacteroidetes son la descomposición de materia orgánica compleja, el movimiento deslizante y su pigmentación por flexirrubina y carotenoides. El reciente auge de métodos independientes de cultivo y desarrollo de técnicas de secuenciación de polinucleótidos, ha revelado la prevalencia de los Bacteroidetes en muchos ecosistemas de relevancia. Como ejemplo, ciertos ambientes salinos parecen seleccionar a estas bacterias frente a las de otros filos. Los objetivos que fija esta tesis son (1) revisar la taxonomía de Bacteroidetes, (2) encontrar genes codificantes que puedan expresar un fenotipo identitario y (3) hallar qué genes son seleccionados en ambientes salinos. Para la revisión taxonómica del filo se ha actualizado no solamente la filogenia basada en el gen ADNr 16S, sino también la del ADNr 23S, nucleótidos firma de la secuencia ARNr 16S, patrones de inserción y deleción en dos proteínas y una filogenia por análisis de secuencias multilocus de 29 genes. Esta nueva taxonomía, además de permitir la denominación de un nuevo filo, tres clases, tres órdenes, ocho familias y un género (todos ellos vigentes en la nomenclatura bacteriana), ha facilitado la filogenómica precisa de los Bacteroidetes, que en estudios anteriores incluía a miembros del nuevo filo Rhodothermaeota. Aunque también, redujo las posibilidades de encontrar genes seleccionados por la salinidad, dado que la mayoría de halófilos extremos pertenecen a este nuevo filo. Mediante la comparación genómica de 89 genomas de Bacteroidetes cuidadosamente seleccionados se reveló que los genes más conservados del filo (en el 90% de los genomas), presumiblemente no constitutivos, son los codificantes para el sistema de secreción tipo IX, hasta la fecha solo descrito en este filo. Este sistema de secreción está relacionado con el movimiento deslizante de algunos Bacteroidetes, pero también es un sistema excretor de enzimas hidrolíticas. A continuación, los genes constitutivos codificantes del súper complejo respiratorio Complejo Alternativo III – citocromo caa3 oxidorreductasa en un 83% de los genomas, todos de organismos aerobios. El linaje anaerobio de los Bacteroidales puede completar la respiración aerobia gracias a un citocromo bd oxidorreductasa con alta afinidad por el oxígeno que les ayuda a eliminarlo de su entorno. El complejo II, succinato deshidrogenasa, de la cadena respiratoria son de copia única en todos los genomas de Bacteroidetes y en los Bacteroidales existen vestigios de otros genes de enzimas del ciclo de ácidos tricarboxílicos que atestiguan su pasado aerobio. Por último, los genes del complejo I de la cadena respiratoria no reproducen un patrón filogenómico en los Bacteroidetes. Estos genes son sustituidos por los de un complejo I alternativo que bombea sodio al espacio intermembranal en lugar de protones, la NADH:quinona oxidorreductasa bombeadora de sodio (Na+-NQR), solamente en organismos marinos o de la microbiota del conducto gástrico. Además, hemos encontrado evidencias de que el complejo fue inventado por los Bacteroidetes y se ha transmitido horizontalmente en ambientes salinos. La expresión conjunta del sistema de secreción tipo IX y la cadena respiratoria de Bacteroidetes, adaptada a cada uno de los ambientes que ocupan, muy probablemente es la responsable de la radiación adaptativa de los Bacteroidetes. Algunos de estos genes son de transferencia horizontal, pero en conjunto predicen que el bacteroidete original era un aerobio heterótrofo de materia orgánica compleja que posiblemente vivía en agua dulce. ABSTRACT The use of ribosomal markers in bacterial systematics intimately linked the Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides groups even though phenotypic studies classified them apart. With regard to phylogenetic evidence, they were circumscribed as the phylum Bacteroidetes but they stay principally studied as independent clades due lack of phenotypic coherence. The phenotypes foremost attributed to Bacteroidetes are the ability to decompose complex organic matter, gliding motility and pigmentation with flexirubins and carotenoids. The recent outburst of cultureindependent methodologies and development of polynucleotide sequencing techniques has unveiled Bacteroidetes’ prevalence in many relevant ecosystems. For example, some saline environments seem to be selective of these bacteria out-competing other phyla. The goals of this doctoral thesis targets are (1) reviewing the taxonomy of the Bacteroidetes, (2) finding coding genes that could translate into an identifying phenotype and (3) finding what of their genes are selected in saline environments. For the taxonomic review of the phylum not only their 16S rDNA gene phylogeny has been updated, but also that of the 23S rDNA, signature nucleotides on their 16S rRNA sequence, insertion/deletion patterns in two of their proteins and a phylogeny based on the multilocus sequence analysis of 29 genes. This new taxonomy, on top of naming a new phylum, three classes, three orders, eight families and a genus (all of them with standing in bacterial nomenclature), paved a precise phylogenomic analysis of the Bacteroidetes, which on earlier studies included members of the new phylum Rhodothermaeota. However, it curtailed probabilities of finding salinity-related genes, since most extreme halophiles belong to the new phylum. Through the compared genomics of 89 meticulously selected genomes we found that the most conserved genes in the phylum (in 90% of the genomes), not housekeeping, are those coding the type-IX secretion system, hitherto only seen in the Bacteroidetes. This secretion system is involved in the gliding motility of some Bacteroidetes, but it is also an excreting route for hydrolytic enzymes. Next, were genes coding the respiratory super-complex Alternative Complex III – cytochrome caa3 oxydoreductase at 83% of the genomes, all of aerobic species. The anaerobic lineage of the Bacteroidales can fulfill the aerobic respiration thanks to a cytochrome bd oxidoreductase with high oxygen affinity that helps detoxifying their surroundings. Genes of the Complex II, Succinate dehydrogenase, of the respiratory chain are singlecopy through all Bacteroidetes’ genomes, and at the Bacteroidales other vestigial genes of the tricarboxylic acid cycle denote their aerobic past. Last, the genes of the respiratory Complex I are not arranged phylogenomically in the Bacteroidetes. These genes are substituted by an alternative complex I that pumps sodium into the intermembrane space instead of protons, the sodium pumping NADH:quinone oxydoreductase (Na+-NQR), only on marine species or gut microbiota species. Moreover, we found evidences of this complex being invented by the Bacteroidetes and its horizontal transmission within saline environments. The simultaneous expression of the type-IX secretion system and the respiratory chain of the Bacteroidetes, which is adapted to the environments they live at, is likely responsible for the adaptive radiation of the phylum. Some of these genes are horizontally transferred, but all together they predict the original bacteroidete was a heterotroph aerobic decomposer of complex organic matter, likely living in freshwater.