Mejoramiento de las técnicas de conservación seminal en la especie ovina

Resumen

En la presente Tesis se han planteado tres experiencias cuyo objetivo global ha sido encontrar una mejora en los diluyentes de congelación y refrigeración seminal ovina, para ello en cada una de ellas se han planteado objetivos parciales, que a continuación se describen: El objetivo de la primera experiencia fue estudiar el efecto combinado de la miel de romero como fuente de energía y crioprotector en combinación con el ajo (Allium sativum) como antibiótico natural en la calidad de los espermatozoides de morueco durante el proceso de refrigeración. En la segunda, el objetivo fue investigar los efectos crioprotectores de la N,N-dimetilformamida (DMF) en la congelación de semen ovino, tanto sóla como en combinación con el glicerol, utilizando en ambos casos una base natural de leche de soja como diluyente en el proceso de criopreservación. Por último, el objetivo de la tercera experiencia fue evaluar el efecto de la sustitución de la yema de huevo fresco por yema de huevo pasteurizada (huevina) en la elaboración de un diluyente, suplementado con dos glúcidos (fructuosa y glucosa) provenientes de la miel. Para realizar nuestro estudio, se utilizaron muestras heterospérmicas, obtenidas a partir de eyaculados procedentes de tres machos ovinos de la raza Rasa Aragonesa, mediante la técnica de extracción por vagina artificial. Estas muestras fueron distribuidas en los distintos diluyentes de refrigeración y congelación de las diferentes experiencias, siendo evaluadas en distintos momentos del protocolo tanto de refrigeración como de congelación para determinar su calidad. Las pruebas realizadas fueron: motilidad total y progresiva, viabilidad, integridad acrosómica y de membranas (Host). Se realizaron en distintos momentos del proceso de refrigeración: 0, 24, 48 y 72 horas postdilución, y del proceso de congelación: postdilución, precongelación, descongelación y 2 horas postdescongelación. Además, se evaluó la integridad del ADN utilizando las técnicas de naranja de acridina y OxyDNA durante el proceso de refrigeración a 4°C a las 24 y 48 horas postdilución. Se realizó también un análisis microbiológico de los distintos diluyentes para cuantificar el poder antibacteriano del ajo, utilizando para ello tres medios de cultivo: Plate Count Agar, Agar Sangre y Agar Sabouraud + Cloranfenicol. Finalmente, se hicieron pruebas de fertilización in vitro para testar los diluyentes de la segunda y tercera experiencia. En la primera experiencia, en la que se estudiaba el efecto combinado de la miel de romero como fuente de energía en combinación con el ajo como antibiótico, como paso previo a la elaboración de los diluyentes de refrigeración, se determinó la concentración de alicina del ajo y de los dos glúcidos (fructosa, glucosa) provenientes de la miel mediante el análisis HPLC. Los resultados mostraron que las motilidades totales y progresivas en los periodos de estudios ofrecieron diferencias significativas entre diluyentes (P<0,001), excepto a las 24 horas (P=0.06; P=0.382). La viabilidad no presentó diferencias en ninguno de los tiempos evaluados y la integridad de los acrosomas mostró diferencias significativas únicamente a las 48 horas (P=0,027), mientras que la integridad de membrana presentó diferencias significativas sólo a las 72horas (P<0,001). En cuanto a las interacciones entre crioprotecotres, a las 24 horas no se observaron diferencias significativas en ninguno de los diluyentes. A las 48 horas se encontraron diferencias altamente significativas (P<0,05) salvo en la viabilidad y la integridad de membrana, siendo los diluyentes con glicerol a una concentración de 6% y/o su combinación de 50/50 con DMF superiores frente al resto. Se comprobó la acción antimicrobiana del ajo: éste ejercía un efecto inhibitorio del crecimiento bacteriano tanto sobre bacterias Gram (+) como Gram (-) sobre las muestras analizadas en los distintos medios de cultivo. La integridad del ADN valorada mediante la tinción de naranja de acridina no determinó diferencias significativas (P >0,05) entre los diluyentes objeto de estudio. De igual manera, realizada la prueba de OxyDNA, no hubo diferencias significativas (P>0,05) entre diluyentes. Sin embargo, pudimos observar que el diluyente F (miel, ajo y glicerol) transcurridas 48 horas y a una temperatura de 4ºC fue el que mejor se comportó frente al estrés oxidativo en comparación al resto de los diluyentes, con sólo un 8,5% de ADN fragmentado. En la segunda experiencia, se valoraba el efecto crioprotector de la DMF en la congelación, sola o en combinación con el glicerol y sobre una base de leche de soja. Se llevaron a cabo cinco congelaciones para cada uno de los diluyentes y a la descongelación se valoró la motilidad individual y progresiva, la viabilidad e integridad acrosómica y de membranas (Host) en distintos tiempos del protocolo de congelación. En postdilución y precongelación no se encontraron diferencias significativas (P>0,05) entre los distintos diluyentes. En el momento de la descongelación tampoco se observaron diferencias significativas (P>0,05) entre los diluyentes testados y el control para viabilidad y el Host test. Observándose diferencias significativas (P=0,001) para la motilidad progresiva (valores más altos para los diluyentes A, B y C) e integridad acrosómica (valores más altos para los controles y diluyentes A y C). La prueba de resistencia térmica (37°C/ 2h) hubo diferencias significativas (P=0,001) entre el diluyente Andromed® y el diluyente A con respecto al Tryladil®, B y C. Se seleccionaron para las pruebas de fertilización in vitro, únicamente los diluyentes que ofrecieron mejores resultados: Andromed® y diluyente A, para evaluar el potencial de fertilización y desarrollo. Los resultados revelaron que ambos diluyentes fueron capaces de llevar a cabo correctamente la fertilización, pero el potencial de desarrollo esperado fue mejor para el diluyente Andromed® en comparación con el diluyente A. La mayor tasa de embriones que llegaron al estadio de 8-16 células se observaron con el diluyente Andromed® y un 75,5%, en el caso del diluyente A se alcanzaron tasas del 56,2%, con una p=0,006. En la tercera experiencia, se realizaron 8 congelaciones para valorar el efecto de la sustitución de la yema de huevo fresco por huevina (huevo pasteurizado) en la elaboración de los diluyentes de congelación, suplementados con dos glúcidos (fructuosa y glucosa) provenientes de la miel. Los resultados observados a la descongelación, mostraron diferencias significativas (p=0,001) siendo el diluyente D4 (miel-huevina) el que valores más altos presentaba. Esta mejora se refleja en los beneficios en la preservación de la motilidad y de la longevidad post-descongelación y en la estabilización de la membrana, superando ampliamente al diluyente control en las distintas fases de la crioconservación de semen de carnero, todos ellos parámetros esenciales para mantener una buena fertilidad. Los efectos de la miel han sido más moderados. Los resultados evidencian discretos pero satisfactorios efectos beneficiosos de la miel en los parámetros analizados. Hemos observado que la adición de un 25% proporciona un efecto beneficioso y un movimiento homogéneo por parte de los espermatozoides, sin que se presente un deterioro de la motilidad en comparación con el medio control hasta su descongelación y posterior mantenimiento durante dos horas. Adicionalmente, los resultados indican que la inclusión de los dos glúcidos contenidos en la miel preservan favorablemente las calidades espermáticas, ya que son la principal fuente de energía necesaria para que los espermatozoides desarrollen sus procesos metabólicos. Contribuyeron además a mantener el equilibrio osmótico. Las pruebas de fertilización in vitro, confirmaron una producción eficiente de embriones en cualquier caso. Tras 48- 72 de cultivo embrionario, la división embrionaria (8-16 células) en los tres medios representaban unos porcentajes elevados, siendo el diluyente D2 el que mayor porcentaje presentaba (86,1%) superior a lo esperado, por el contrario el diluyente D4, presento un valor inferior (73,0%) para un valor de p=0,034 en relación al diluyente control (77,4%). Las conclusiones generales del estudio son que el uso de la N,N-Dimetilformamida (DMF) como crioprotector, tanto en refrigeración como en congelación no aporta una mejoría frente al uso del glicerol. La miel, por sus características, puede ser utilizada como fuente energética en la elaboración de diluyentes de refrigeración y congelación en la especie ovina. La utilización del ajo, como agente antimicrobiano, permite la sustitución de antibióticos en la elaboración de los diluyentes de conservación seminal. El uso de yema de huevo pasteurizada en sustitución de la yema de huevo fresca, en los diluyentes de congelación, supone una alternativa en la elaboración de los mismos, facilitando el proceso de preparación así como aportando el mismo efecto protector en el proceso de congelación de los espermatozoides de ovino.