Immune response in fish gonad upon nodavirus infection and vaccines development = Implicación de la respuesta inmunitaria de la gónada de peces durante una infección con nodavirus y desarrollo de vacunas

  1. Valero Cuesta, Yulema
Dirigida por:
  1. Alberto Cuesta Peñafiel Director/a
  2. María Ángeles Esteban Abad Director/a
  3. Elena Chaves Pozo Director/a

Universidad de defensa: Universidad de Murcia

Fecha de defensa: 27 de julio de 2016

Tribunal:
  1. Alfonsa García Ayala Presidente/a
  2. Julia Béjar Alvarado Secretario/a
  3. Panagiotis Logothetis Vocal

Tipo: Tesis

Resumen

La dorada (Sparus aurata) y la lubina (Dicentrarchus labrax) son las especies de peces más importantes de la acuicultura Mediterránea y de España. Entre los principales problemas que impiden la mejora de su cultivo se encuentran las pérdidas económicas provocadas por patologías. Nodavirus (NNV), extendido por todo el mundo, incluido el Mediterráneo, produce elevadas mortalidades en lubina, sobre todo en larvas, mientras que infecta a doradas sin producir enfermedad. Además, NNV se transmite verticalmente y no existen métodos preventivos efectivos. Por ello, en esta Tesis Doctoral hemos estudiado la interacción entre la gónada de dorada/lubina y NNV y la respuesta inmunitaria desencadenada en cerebro y gónada de ambas especies (Parte 1ª con cuatro capítulos) y cómo prevenir la enfermedad en ejemplares mediante vacunación (Parte 2ª con 2 capítulos). Para ello, realizamos infecciones experimentales con NNV en lubinas y doradas observándose un 55% de mortalidad en la lubina y total resistencia en la dorada. Inicialmente, demo9stramos que NNV podía colonizar y replicar en el testículo de ambas especies detectándose RNA viral y rescatándose partículas infectivas mediante pases ciegos en líneas celulares en ambas especies. Además, se localizaron proteínas virales de la cápsida (CP y B2. Es más, NNV infectó células somáticas de ambas especies, aunque sólo células germinales de dorada. La infección con NNV alteró la síntesis y los niveles séricos de 17?-estradiol y 11-ketotestosterone así como la sensibilidad del cerebro y del testículo a estas hormonas, mientras que no hubo alteración de las funciones testiculares en ninguna especie según el índice gonadosomático, la morfología testicular y la expresión del gen dmrt1. Respecto a la respuesta inmunitaria, NNV desencadenó una alta respuesta inflamatoria en cerebro y gónada de lubina aunque en dorada dicha respuesta fue mucho menor. El interferón (IFN) es uno de los mecanismos antivirales más potentes. En esta Tesis hemos identificado varios genes de dorada y lubina que codifican moléculas implicadas en la ruta del IFN y evaluamos su expresión durante una infección con NNV en cerebro y gónada. En dorada, los genes identificados fueron mda5, tbk1, irf3, ifn, mx y pkr, cuya expresión se estimuló en cerebro pero no en gónada. Sin embargo, en lubina, además, también identificamos las secuencias génicas de lgp2, mavs, traf3, tank e irf7, siendo en la mayoría de ellos inhibida su expresión en cerebro pero estimulada en gónada. De una forma diferente a lo que ocurría con el IFN, la expresión de varios genes que codifican péptidos antimicrobianos (AMPs) se estimuló en el cerebro y gónada de lubina mientras que en dorada sólo se inhibió c3. Mediante una infección in vitro de gónada, pudimos determinar que, mientras algunos de los genes (hamp, dic y lyz) eran regulados localmente por la gónada otros (c3, bdef, pis) dependían más de la respuesta inmunitaria sistémica. Además de su función en la compactación del DNA durante la división celular, las histonas parecen poseen funciones antimicrobianas. Por ello, identificamos la secuencia completa de los genes que codifican las histonas H1 y H2b en lubina y dorada y estudiamos su expresión frente a NNV. Nuestros datos sugieren que la histona H1 puede tener un papel determinante en la respuesta inmunitaria contra NNV en el cerebro de las dos especies, mientras que la histona H2B parece ser más relevante en la respuesta inmunitaria de los leucocitos de riñón cefálico (HKLs). NNV es letal durante el desarrollo larvario, siendo estos estadios, además, muy difíciles de vacunar debido a que su sistema inmunitario es inmaduro y a su pequeño tamaño. Teniendo en cuenta la dificultad de aplicación de vacunas inyectables a peces pequeños, encapsulamos una vacuna de DNA contra NNV en nanopartículas de quitosano y la administramos oralmente a juveniles de lubina durante 2 días. A los 90 días no se detectaron anticuerpos específicos frente a NNV pero se observó un incremento de la citotoxicidad mediada por células (CMC) y la respuesta del IFN en el intestino posterior así como un retraso en el comienzo de la mortalidad y una supervivencia del 45% tras una infección experimental. Después, estudiamos la posibilidad de inducir la inmunidad pasiva de las larvas mediante la vacuna de DNA administrada a las hembras progenitoras. Así, la inyectamos intramuscularmente en hembras reproductoras de lubina observando transferencia materna de proteínas con función bactericida, pero no de sus mRNA, ya que en huevos recién fertilizados vacunados esta actividad aumentó. No obstante, la inmunización de hembras reproductoras estimuló una respuesta innata mayor y más temprana. En resumen, nuestro estudio demuestra por primera vez la localización de NNV en células de testículo en peces y cómo la infección afecta a las funciones inmuno- endocrinas y la sensibilidad de los tejidos infectados a hormonas sexuales. Finalmente, diseñamos una vacuna de DNA con resultados prometedores como herramienta preventiva contra NNV cuando se administra a juveniles o reproductores. Gilthead seabream (Sparus aurata) and European sea bass (Dicentrarchus labrax) are the most important fish species for the Mediterranean aquaculture and also for Spain. Among the problems to improve their culture are the economic losses produced by pathologies. Thus, nodavirus (NNV), which is spreading worldwide, produces very high mortalities in sea bass, a very susceptible species, and uses seabream as a resistant reservoir. In addition, this virus shows vertical transmission through gametes and gonadal fluids and no clearly effective preventive methods are available. Thus, we aimed in this Doctoral Thesis to evaluate the interaction between seabream/sea bass gonad and NNV (part 1, with four chapters) and how to prevent its pathology and dissemination (part 2, with two chapters). First, we have demonstrated that NNV was able to colonize and replicate into the testis of both species, since infective viral particles were rescued using cell culture techniques. capsid (CP) and B2 viral proteins were also detected in gilthead seabream testis. Moreover, the cells infected in the testis were somatic cells in both species and also germ cells in gilthead seabream. Regarding reproductive functions, NNV infection altered 17?-estradiol and 11-ketotestosterone production and serum levels and the sensitivity of brain and testis to these hormones, whereas there was no disruption of testicular functions according to several reproductive parameters. Attending to the immune response elicited by the NNV infection, a higher inflammatory response was observed in the gonad and brain of sea bass compared to seabream specimens that, in contrast to sea bass specimens, were able to overcome the infection. The interferon (IFN) pathway, one of the most powerful antiviral mechanisms, was extensively depicted in seabream and sea bass and evaluated upon NNV infection in brain and gonad. In seabream, the genes encoding for MDA5, TBK1, IRF3, IFN, Mx and PKR proteins were up-regulated in the brain and unaltered in the gonad. In additioin to these genes, genes coding for LGP2, MAVS, TRAF3, TANK and IRF7 proteins were identified in European sea bass and most of them were down-regulated in the brain but significantly up-regulated in the gonad. We also studied the antimicrobial peptides (AMPs) response upon NNV infection. Differently to the IFN response, the AMPs response is generally increased in the brain of the European sea bass and in the gonad of both species upon NNV infection. Interestingly, our in vitro results determined that while some AMPs coding genes (hamp, dic and lyz) were locally regulated and represented a local immune response in the gonad, others (c3, bdef and pis) are more dependent of the systemic immune system. Additionally, and taking into account the potential antimicrobial role of histones, we have identified the complete h1 and h2b coding sequences in sea bass and seabream and studied their pattern of expression upon NNV in vivo infection. The data obtained suggest that H1 might have a role in the immune response against NNV in the brain of both species while H2B seems to be more important in the head-kidney leucocyte immune response. NNV is extremely harmful during larval development and at these early stages are very difficult to be vaccinated due to their small size or their immature immune system. Taking into account the difficulty of injecting a vaccine to a very small immunocompetent juvenile specimens, we have chitosan-encapsulated a DNA vaccine (ChP-CP-pNNV) against NNV and administered orally to early juveniles of European sea bass during two days. After 90 days of vaccination the cell-mediated cytotoxicity and IFN responses were greatly enhanced in the hindgut, although no specific anti-NNV antibodies were detected in serum. In fact, challenged specimens showed a retarded onset of fish death and a relative percent survival (RPS) of 45%. Then we have studied the possibility to induce maternal transfer of immunity using DNA vaccination to not immunocompetent specimens. Thus, we intramuscularly vaccinated the females of a broodstock of European sea bass with the formulation of the DNA vaccine CP-pNNV aiming to trigger a protective immune status in the progeny at early developmental stages. The vaccine elicits the maternal transference of some bactericidal activity effectors since eggs from vaccinated group showed increased activities at 0 days post-fertilization. Indeed, the maternal transfer described in our work seemed to be restricted to protein factors as transcript levels of mRNA of several leucocyte markers or AMPs were undetected in eggs. Interestingly, the immunisation of the broodstock females promoted a higher and earlier innate immune response in their progeny than in controls. In conclusion, our study demonstrate for the first time the localization of NNV into the testis cells in fish and how the immune-reproductive interactions are regulated by NNV, which may be hiding in the gonad and likely using it to spread to the progeny. Furthermore, we have designed a DNA vaccine that shows promising properties as preventive tools against NNV disease when administered to juveniles or broodstocks.