Función de VE-Cadherina no endotelial en el desarrollo del Mimetismo Vasculogénico en melanoma

  1. Delgado Bellido, Daniel
Supervised by:
  1. Angel Garcia Alonso Director
  2. Francisco Javier Oliver Pozo Director

Defence university: Universidad de Granada

Fecha de defensa: 19 December 2019

Committee:
  1. Abelardo López Rivas Chair
  2. Juan Carlos Rodriguez Manzaneque Escribano Secretary
  3. Eva Siles Rivas Committee member
  4. María Dolores Chiara Romero Committee member
  5. Mireia Duñach Masjuan Committee member

Type: Thesis

Abstract

El fenómeno de angiogénesis tumoral denominado mimetismo vasculogénico (VM) se ha desarrollado como mecanismo aberrante de angiogénesis de supervivencia y adaptación a las condiciones que sufren las células tumorales revertidas a un fenotipo y genotipo desdiferenciado. El estudio de la formación, estabilización y progresión de los vasos sanguíneos en el cáncer se remonta a la década de 1960. En un inicio se realizaron diversas aproximaciones en el conocimiento de angiogénesis tumoral, siendo implicada en este enfoque principalmente como actor principal la liberación de VEGF por parte de las células tumorales con la consiguiente atracción sobre la producción de angiogénesis aberrante por crecimiento en brotación por parte de las células endoteliales adyacentes al tumor. En la década de 1990, se modelizaron diferentes mecanismos de angiogénesis tumoral, estando bajo sospecha de actuación las propias células tumorales en la formación de la angiogénesis tumoral. En la presente tesis titulada “Función de VE-Cadherina no endotelial en el desarrollo del mimetismo vasculogénico en melanoma”, hemos elucidado el posible rol de VE-Cadherina, más en concreto, como la fosforilación en el residuo Y658 puede formar parte integrante del mecanismo de formación de VM por parte de las células tumorales de melanoma cutáneo y uveal. Los cambios postraduccionales de VE-Cadherina se han estudiado con eficiencia en diversos modelos de dinámica inter-celular y/o célula-célula, siempre sobre el foco mecanístico por parte de las células endoteliales normales. Colateralmente, la pY658 de VE-Cadherina se ha introducido como posible diana de la quinasa de adhesiones focales (FAK) en modelos tumorales. De hecho, la inhibición de la FAK a través del tratamiento específico inhibitorio de la actividad de la misma (PF-271) o su silenciamiento (siRNA FAK), incapacitó la posible fosforilación del residuo Y658 de VE-Cadherina con la consiguiente depleción de formación de VM en las líneas celulares MUM 2B (melanoma uveal) y C8161 (melanoma cutáneo) con capacidad de formar VM. Por otro lado, es conocido que la dinámica de trafico intracelular entre los movimientos de las cadherinas son dependientes de las proteínas ancladas a las mismas, dichas proteínas pertenecen a la familia de las cateninas. Más en detalle, la catenina denominada p120 por su peso molecular, está envuelta en el desplazamiento o mantenimiento en membrana de E-Cadherina y de VE-Cadherina, todo ello orquestado por los diversos factores solubles que pueden repercutir en la localización intracelular de las mismas. La función de E-cadherina sobre la dinámica intracelular ha sido ampliamente estudiadas en diversas localizaciones intracelulares en compañía con p120 y beta-catenina y estas a su vez tienen unión con diferentes factores transcripcionales (Kaiso). En esta tesis, a través de experimentos tanto por experimentos de subfraccionamiento celular y co-immunoprecipitación detectamos a VE-Cadherina formando complejo con p120 y Kaiso en el compartimento intracelular nuclear y que la inhibición de la FAK abolía dicha unión. Se ha reportado con anterioridad el posible impacto que puede suponer la unión de p120 a Kaiso y su desplazamiento a compartimentos subcelulares anómalos en la ruta de señalización de E-Cadherina y la consiguiente repercusión transcripcional sobre los genes dependientes de Kaiso. Nuestros resultados muestran y como aquí reportamos, VE-Cadherina es parte integrante del complejo p120/Kaiso en células de melanoma con capacidad de formar VM. La inhibición de la FAK o el silenciamiento de VE-Cadherina reprimen la expresión de los genes dependientes de Kaiso, por acumulación y reclutamiento del mismo sobre los promotores de CCND1 y WNT 11, como así también disminuye la capacidad de formación de VM. El desarrollo de la línea celular MUM 2B K.O para VE-Cadherina a través de la tecnología de edición génica CRISPR-Cas 9, nos permitió analizar el impacto que tiene la fosforilación de la Y658 de VE-Cadherina sobre la formación de VM. El rescate de VE-Cadherina WT revertía la capacidad de VM, por el contrario, el rescate de VE-Cadherina Y658 mutada a F (por tanto, no fosforilable) impidió a la línea celular MUM 2B producir VM. Demostrando así, la importante acción por parte de VE-Cadherina y la fosforilación basal en el residuo Y658 en el desarrollo aberrante de angiogénesis tumoral. Finalmente, la implicación de VE-PTP sobre la dinámica y movimiento intracelular de VE-Cadherina está siendo objeto de estudio en la última década en relación a la función de la célula endotelial. En la presente tesis hemos abordado la posible actuación de VE-PTP en la formación de VM. Así, la expresión de VE-PTP se correlaciona con la de VE-Cadherina en las líneas celulares de melanoma uveal (MUM 2B) y cutáneo (C8161). Esta VE-PTP es esencial en el mantenimiento y estabilidad de VE-Cadherina, ya que su silenciamiento degrada a VE-Cadherina con la consiguiente depleción de formación de VM en experimentos de angiogénesis in vitro. Todo ello, debido en parte, a la disminución de expresión de los genes diana dependientes de Kaiso (CCND1 y WNT 11). Por otro lado, a través de experimentos de co-inmunoprecipitación de p120 tras el silenciamiento de VE-PTP, comprobamos un incremento de las fosforilaciones globales sobre las tirosinas de p120, lo que sugería que VE-PTP podría estar implicada en la dinámica de mantenimiento del estado de fosforilación de p120 y en el mantenimiento del complejo pY658/p120. La persistencia de este complejo, incluso tras la fosforilación de VE-cadherina, puede estar en la base de la adquisición de plasticidad celular por parte de las células de melanoma con capacidad de VM. Como conclusión, el estado de fosforilación de VE-Cadherina en el residuo Y658 confiere a las células de melanoma con capacidad de formación de VM adquirir una plasticidad y una capacidad de diferenciación parcial para así llevar a término el desarrollo tumoral, orquestado por la acción y unión de p120 y VE-PTP sobre VE-Cadherina y ejerciendo un efecto sobre la transcripción de genes implicados en el mantenimiento de VM. El estado de activación permanente de la quinasa FAK es, en parte, responsable de la fosforilación continúa de VE-cadherina y la inhibición de FAK impide las acciones indebidas de la pY658 en el VM, siendo, por tanto, una posible diana terapéutica para impedir el desarrollo aberrante de VM.