Sistemas nanoparticulares autoensamblados basados en ciclodextrinas para el transporte de fármacos y material génico

Zusammenfassung

Las beta-ciclodextrinas (bCD) juegan un papel importante en el desarrollo de estructuras supramoleculares, a veces llevando a nuevas propiedades biofuncionales. En esta Tesis, la bCD se ha usado como plataforma modelo para la preparación de estructuras bien definidas para la inhibición de la toxina del ántrax y transporte controlado de fármacos y genes. Metodologías de funcionalización eficientes tales como la formación de 1,2,3-triazoles catalizada por Cu(I) (CuAAC) o el acoplamiento entre aminas e isotiocianatos se han usado para la generación de diversidad molecular. Esta estrategia general ha demostrado ser útil para acceder a series de macromoléculas monodispersas para estudios de estructura-actividad. - Inhibición de la toxina de ántrax. En la literatura se describe que preporos de la toxina de ántrax pueden ser bloqueados por derivados policatiónicos de bCD simétricas, evitando la internalización de factores tóxicos e inhibiendo en el rango micromolar la acción de la toxina. Una serie de clústeres clic construidos sobre la cara primaria de la bCD se prepararon mediante la reacción CuAAC, lo que permitió controlar parámetros tales como la densidad de carga catiónica o la longitud del espaciado entre el núcleo de la bCD y el clúster. En los resultados de inhibición en RAW 264.7 no se observó actividad en contraposición a análogos basados en tioureas, posiblemente debido a restricciones conformacionales que evitan la interacción entre el preporo y el clúster. No obstante, se demostró que la CuAAC está bien adaptada a la generación de diversidad molecular de manera eficiente. - Transporte de fármacos. Aunque las bCDs han sido usadas ampliamente en transporte de fármacos para mejorar las características de la formulación, un problema asociado es la baja capacidad de carga. Derivados per(O-2,O-3)-hexanoil bCD neutras son capaces de autoorganizarse en agua mediante nanoprecipitación para dar nanopartículas poco polidispersas, capaces de encapsular fármacos con altas cargas y liberarlos de manera gradual. Para mejorar las características de las nanopartículas basadas en bCDs como sistemas de transporte de fármacos, hemos desarrollado una serie de conjugados de bCD diméricas con capacidad de autoorganización, constituidas por una unidad hidrófoba y una unidad hidrófila, separadas mediante un espaciador de longitud definida. Las nanoesferas resultantes fueron caracterizadas por dispersión dinámica de láser y medidas de potencial zeta, mostrando además capacidad de encapsular Diazepam (~76 % de eficiencia) y liberarlo de manera controlada. Las propiedades mejoradas de complejación supramolecular de las nanoesferas se usaron para la funcionalización via supramolecular con conjugados de adamantilmanopiranósidos, dotando a las nanopartículas de capacidad de reconocimiento por lectinas. Esto fue confirmado mediante la realización de ensayos ELLA. - Transporte de genes. La funcionalización de dominios hidrófilos y lipófilos en el núcleo de la bCD permite el acceso a derivados que se comportan como sistemas eficientes de transporte de genes. Una primera generación de CD policatiónicas anfifílicas (paCDs) se prepararon mediante CuAAC, ajustando la densidad catiónica, flexibilidad del clúster o el balance hidrófilo-lipófilo. Estos vectores mostraron capacidad de complejar y proteger ADN tras la formación de complejos (CDplejos) , así como promover la transfección en células CHO-k1 con eficiencias similares a las de la LipofectaminaTM2000. Una segunda generación se sintetizó mediante la combinación de la CuAAC usando catalizadores heterogéneos para facilitar las condiciones de preparación, con la reacción de formación de tioureas, demostrándose que la combinación de ambas estrategias es adecuada para la generación de diversidad molecular. Los resultados indican que estas reacciones secuenciales representan una estrategia versátil para optimizar las propiedades de transporte de genes basadas en paCDs. La incorporación de segmentos lineales de oligoetilenimina mediante las metodologías descritas anteriormente permitió la preparación de sistemas eficientes de transporte de genes, siendo también adecuadas para el transporte de pequeños ARN interferentes en células U-87. Los ensayos MTT indicaron ausencia de toxicidad. Las propiedades de autoorganización de paCDs basadas en tioureas o triazoles en ausencia y presencia de ADN también se han estudiado, esencialmente mediante técnicas de dispersión de luz y microscopía. Los resultados sugieren que las paCDs pueden comportarse como cristales líquidos. Además, se evaluó la capacidad terapéutica de los vectores de genes in vivo. Tras una criba previa en función de la eficiencia de transfección en líneas celulares humanas (HeLa, HepG2) a altas concentraciones de suero (60%) se seleccionó un candidato que se usó para promover la transfección in vitro de un plásmido que codifica una proteína terapéutica, la interleuquina 12. Ensayos de transporte de genes in vivo por inyección sistémica en ratones mostraron niveles relativamente altos de transfección en hígado de genes reporteros. Para promover el transporte dirigido de genes se prepararon y evaluaron una serie de CDs policatiónicas glicoanfifílicas (pGaCDs) que se encuentran funcionalizadas con ligandos de manosa biorreconocibles. Ensayos ELLA mostraron una alta afinidad de los correspondientes glicoCDplejos por concanavalina A así como por un receptor de manosa de macrófagos humanos recombinante. La evaluación de de la habilidad de adhesión de las CDplejos manosilados confirmaron los resultados obtenidos por ELLA. Por otra parte, la transfección mediada por receptor se estudió en RAW264.7 en presencia de un ligando competidor así como por experimentos FACS. Para investigar la influencia de las distintas proporciones de ligando de manosa en la superficie del nanocomplejo, una serie de pGaCDs estadísticas han sido preparadas. Los experimentos de transfección mostraron un incremento gradual de la eficiencia, que fue más marcada en el caso de células RAW264.7. Finalmente, una nueva familia de prototipos de vectores de genes macromoleculares ha sido propuesta, consistente en paCDs diméricas altamente preorganizadas. Para ello, el paso clave es la monorreducción de la per(O-2, O-3)-alquil-per-(C-6)-azido bCD a la monoamina correspondiente. Tras formación del dímero se llevó a cabo la CuAAC sobre 12 grupos azido y obtención de los hidrocloruros correspondientes. Los resultados preliminares indican propiedades de transporte de genes mejoradas en los sistemas diméricos, posiblemente debido a una mayor estabilidad de los CDplejos resultantes.