Efecto de la recombinación de segmentos genómicos de betanodavirus en la adaptación del virus a su huésped

Resumo

Los betanodavirus (familia Nodaviridae) son los virus causantes de la necrosis nerviosa viral, una de las enfermedades virales más serias que afecta a larvas y juveniles de numerosas especies de peces marinos en todo el mundo. Su genoma está formado por dos moléculas de ARN monocatenal ARN1 y ARN2 que codifican la polimerasa viral y la proteína de la cápside, respectivamente. La clasificación de estos virus, en base a su ARN2, incluye 4 genotipos, siendo los genotipos “Redspotted Grouper Nervous Necrosis Virus” (RGNNV) y “Striped Jack Nervous Necrosis Virus” (SJNNV) los que se detectan en la península ibérica. Además, los estudios más recientes han descrito en el sur de Europa un número significativo de virus recombinantes de tipo RGNNV/SJNNV aislados principalmente de lenguado. El trabajo realizado en esta tesis se ha centrado en estudiar los factores implicados en la patogénesis de cepas recombinantes de betanodavirus en lenguado y rodaballo. Los resultados indicaron que el lenguado es muy susceptible a estos virus y que en comparación con cepas de genotipo parental (RGNNV y SJNNV), la cepa recombinante (RGNNV/SJNNV) Ss160.03 es la cepa más eficaz infectando esta especie ya que llega al cerebro con celeridad, alcanzando unos altos niveles de replicación, y es la que causa signos clínicos más acusados y mortalidad más rápidamente tras una infección por inmersión, la ruta más parecida a la infección natural. En un estudio previo se observó que los betanodavirus recombinantes aislados de lenguado presentaban una cápside SJNNV con ligeras modificaciones. La comparación de la secuencia de estas cepas reveló que todas compartían sustituciones aminoacídicas en las posiciones 247 y 270 localizadas en el extremo carboxilo-terminal de la proteína capsidal, una región relacionada con la especificidad de huésped en betanodavirus. En este trabajo se investigó el papel de estos aminoácidos como posibles determinantes de virulencia. A partir de un sistema de genética inversa se generaron tres cepas mutantes: la cepa rSs160.03247 (Ser247Ala), rSs160.03270 (Ser270Asn) y rSs160.03247+270, con cambios aminoacídicos en la cápside que las asemejan más una cápside SJNNV “tipo”. Estos virus recombinantes presentaron una atenuación con respecto a la cepa salvaje, con una reducción de la mortalidad del 40% por lo que se comprobó que ambos residuos desempeñan un importante papel en la virulencia de los betanodavirus. Es importante recalcar que no se observó un efecto sinérgico de ambas mutaciones ya que cuando ambas mutaciones estaban presentes (247 y 270) el virus recombinante correspondiente no se atenuó más allá de lo que lo hicieron los virus que sólo contenían una posición cambiada. Por otro lado, se ha estudiado el efecto que tiene la temperatura del agua sobre la infección de betanodavirus recombinantes en lenguado. Para ello se realizaron infecciones experimentales usando la cepa Ss160.03, por inmersión y cohabitación, y a tres temperaturas distintas, dentro del rango en las que se puede encontrar esta especie: 22, 18 y 16 °C. En los distintos experimentos se analizó la mortalidad y la carga viral presente en el cerebro de los peces infectados. Los resultados mostraron una disminución de la mortalidad con el descenso de la temperatura. Las mortalidades más elevadas en esta especie se registraron a 22 °C, mientras que a 18 °C las mortalidades descienden en torno al 25-30%, y a 16 °C se registró una mortalidad discreta (sobre un 8%). A 16 °C se detectó el establecimiento de una infección subclínica en la mayoría de los peces infectados, en los que se observó la aparición de signos clínicos compatibles con el desarrollo de encefalopatía y retinopatía viral al elevar la temperatura por encima de los 18 °C. Por otro lado, los resultados de mortalidad en peces expuestos al virus por cohabitación fueron muy similares a los observados en peces infectados por baño, lo que indicó una gran efectividad de la transmisión horizontal. Debido a la importancia que el cultivo del rodaballo tiene en la acuicultura en Galicia, en este trabajo se analizó, además, la susceptibilidad del rodaballo a la cepa Ss160.03 aislada de lenguado. Se demostró que el rodaballo presenta una moderada susceptibilidad a la cepa recombinante natural. Se obtuvieron niveles moderados de mortalidad, que a 18 °C alcanzaron un máximo del 50%, causados por la cepa recombinante, mientras que se produjeron niveles bajos de mortalidad (17%) en el grupo de peces infectados con la cepa del genotipo parental SJNNV. Se pudo comprobar, además, que al igual que ocurre con el lenguado, la temperatura es un factor importante para controlar la infección por betanodavirus en rodaballo, ya que en las infecciones experimentales se observa un claro descenso de la mortalidad al reducir la temperatura. Por último, se realizaron infecciones experimentales con las cepas recombinantes anteriormente mencionadas (rSs160.03247, rSs160.03270 y rSs160.03247+270). Se observó que las interacciones entre el virus y los receptores celulares parecen ser diferentes en rodaballo y lenguado, ya que las mutaciones de los aminoácidos de la cápside implicados en la patogenicidad para lenguado (S247A o S270N) tuvieron sólo un ligero efecto en la mortalidad en rodaballo (reducción del 10% en ambos casos). Sin embargo, a diferencia de lo que ocurre en el lenguado, la mutación de las dos posiciones redujo la mortalidad más del 50% con respecto a los peces infectados con la cepa salvaje. En resumen, en este trabajo se ha descrito la alta susceptibilidad del lenguado a la infección por betanodavirus y la moderada susceptibilidad del rodaballo. Se han descrito dos posiciones aminoacídicas localizadas en la proteína de la cápside que juegan un papel importante en la virulencia de estos virus para ambas especies y se ha observado una clara disminución de la virulencia de estos virus cuando se reduce la temperatura.