Vacunación en rodaballo, Scophthlamus maximus (L.)análisis de la respuesta inmunitaria y desarrollo de nuevos adyuvantes

Resumo

En esta tesis doctoral se ha analizado la respuesta inmunitaria innata y adaptativa del rodaballo durante la vacunación con el escuticociliado Philasterides dicentrarchi y se han desarrollado nuevos adyuvantes basados en polímeros de origen natural. Capítulo 1 Se ha empleado un chip de ADN para examinar los cambios en la expresión génica en células peritoneales de rodaballo después de la inyección con vacunas que contienen antígeno de membrana de P. dicentrarchi y uno de los siguientes adyuvantes: microesferas de quitosano-PVMMA, adyuvante completo de Freund, gel de hidróxido de aluminio o Matrix-Q. Se identificaron 374 genes que se expresaron diferencialmente en todos los grupos de peces. Cuarenta y dos genes relacionados con uniones estrechas y adherencias focales y/o citoesqueleto de actina se expresaron diferencialmente en las células peritoneales libres. Los cambios profundos en la expresión génica relacionados con la adherencia celular y el citoesqueleto pueden estar asociados con la migración celular y también con la formación de masas de vacuna y células y su unión a la pared peritoneal. Además, se expresaron diferencialmente treinta y cinco genes relacionados con la apoptosis. Aunque la mayoría de las proteínas codificadas por estos genes tienen un efecto proapoptótico, otras son antiapoptóticas, lo que indica que ambos tipos de señales se producen en los leucocitos peritoneales de los peces vacunados. Curiosamente, muchos de los genes relacionados con los linfocitos y su actividad se regularon negativamente en los grupos inyectados con la vacuna. También se ha observado una disminución en la expresión de genes relacionados con la presentación del antígeno, lo que sugiere que los macrófagos, que son abundantes en la cavidad peritoneal después de la vacunación, no los expresaron durante la respuesta inflamatoria temprana en la cavidad peritoneal. Finalmente, varios genes que participan en la respuesta inflamatoria se expresaron diferencialmente, y la mayoría participó en la resolución de la inflamación, lo que indica que se genera una respuesta de macrófagos M2 en la cavidad peritoneal de los peces un día después de la vacunación. Capítulo 2 El bazo de peces es un órgano rico en linfocitos, particularmente en linfocitos B, que desempeña un papel relevante en la respuesta inmunitaria adaptativa después de la vacunación. Se han analizado las poblaciones de células B (células positivas para IgM, IgT o IgD) y la expresión génica de las imunoglubulinas igm, igt e igd y de varios genes relacionados con el sistema inmunitario en el bazo de rodaballos inmunizados con una vacuna que contiene un adyuvante oleoso y antígeno entero inactivado de P. dicentrarchi. Los peces se inmunizaron los días 0 y 30, y las muestras se obtuvieron en los días 3, 7, 33, 37 y 60. La vacuna provocó un aumento significativo en la IgM sérica específica a 37 días y a 60 días, pero los niveles específicos de IgT no variaron en los peces vacunados. No se encontró una gran regulación de sigt, migt, sigm, migm e igd antes de 37 días, mientras que a 37 días se detectó una regulación positiva del gen sigt en peces inyectados con vacuna. Además, a tiempos más cortos la expresión de las inmunoglubulinas se reguló negativamente en el grupo vacuna. Además,se produjo una pobre regulación de los genes relacionados con el sistema inmunitario. Por otra parte, se diseñó un anticuerpo que reconoce, en suero de rodaballo, una banda de alrededor de 70 kDa en Western blot, que ha sido identificada como la cadena pesada de la IgT mediante espectrofotometría de masas. La identificación de linfocitos B por inmunofluorescencia permitió su clasificación en cuatro poblaciones: IgM+IgD-IgT- (la mayoría de las células IgM+), IgM+IgD+IgT-, IgM-IgD+IgT- (muy pocas células) e IgM-IgD-IgT+. Las células IgM+ e IgT+ aparecieron dispersas por todo el parénquima del bazo o agrupadas alrededor de los vasos y del tejido linfoide asociado a los centros melanomacrofágicos (MMCs). La proliferación celular se determinó mediante el uso de una combinación de anticuerpos anti-IgT o anti-IgM y anti-PCNA. La proliferación de células B se observó casi exclusivamente en el tejido linfoide asociado a los MMCs. Durante la vacunación o infección con P. dicentrarchi, el número y el tamaño de MMCs aumentó, observándose en todos ellos células B (IgT+ o IgM+) en proliferación. La vacunación generó un aumento en la cantidad y en la proliferación de células B IgM+ e IgT+, y de otros tipos celulares, en el área de tejido linfoide que rodea a los MMCs, lo cual sugiere una cierta analogía de esta zona con los centros germinales de mamíferos y aves. Además, se observaron células B IgM+ o IgT+ (muchas de ellas en proliferación) en la masa de vacuna y células (CVM) asociada al bazo, lo que puede indicar cierta relevancia de la CVM durante la vacunación, siendo más que un mero lugar de fagocitosis e intercambio de material. Capítulo 3 El receptor de manosa (MRC1) es un receptor de unión a carbohidratos expresado en algunas poblaciones de macrófagos, células dendríticas y endotelio no vascular que juega un papel importante en la internalización y presentación de antígeno. Aunque existe abundante información sobre este receptor en mamíferos, se sabe poco sobre su modulación durante la vacunación en peces. En este estudio hemos clonado y secuenciado la región codificante de dos genes del receptor de manosa tipo C-1, que hemos denominado mrc1-1 y mrc1-2. Se identificaron cuatro dominios potenciales (péptido señal, dominios extracelulares, región transmembrana y dominio citoplasmático) en ambas moléculas. La región extracelular está formada por un domino N-terminal rico en cisteína (CR), uno de fibronectina tipo II (FNII) y ocho dominios de lectina tipo C (CTLD). Además, están presentes otros sitios importantes para la regulación de la actividad del receptor de manosa: residuos conservados de cisteína y residuos aromáticos F (Phe) y W (Trp), sitios conservados (EPN y WND) de dominios de reconocimiento de carbohidratos (CRD), sitios de unión a Ca+2, dos motivos potenciales de endocitosis (F-N-Y y LX) y el residuo ácido conservado “D”. La masa molecular prevista de las proteínas Mrc1-1 y Mrc1-2 es de 162,5 kDa y 162,4 kDa, respectivamente, y ambas moléculas muestran una identidad del 44,71%. Los porcentajes de identidad de las dos isoformas están en torno al 39-50% con mamíferos y aves, y entre el 37-49% con reptiles y anfibios. Se ha diseñado un anticuerpo Anti-Mrc1-1 que reconoce una banda de alrededor de 158 kDa. Mediante inmunohistoquímica, identificamos células Mrc1+ dispersas en el riñón y el bazo, cuya morfología es compatible con macrófagos. Los dos genes mostraron una mayor expresión constitutiva en riñón anterior y en el bazo. Además, se estudió la regulación de mrc1-1 y mrc1-2 durante la vacunación con P. dicentrarchi y el adyuvante oleoso MontanideTM ISA 763 A VG. Ambos genes se regularon positivamente en riñón anterior y bazo de grupos inyectados con adyuvante y antígeno, indicando una interacción entre el escuticociliado y el sistema inmunitario innato del rodaballo. Capítulo 4 La mieloperoxidasa (MPO) es una enzima que está presente principalmente en los neutrófilos. Aunque esta proteína está bien caracterizada en mamíferos, se sabe poco sobre su estructura y función en peces. En este trabajo, se secuenció el gen de la peroxidasa de neutrófilos de rodaballo y se estudiaron algunas de sus funciones. El gen de la mieloperoxidasa de rodaballo, de 5690 pb, contiene un ORF con 14 exones. Además de los 13 intrones del ORF, hay un intrón de 134 nucleótidos ubicado en la región 5 UTR. Las regiones 5’ y 3’ no traducidas tienen 111 pb y 970 pb, respectivamente. La secuencia codificante contiene 2301 nucleótidos que codifican un polipéptido de 767 aminoácidos con una masa molecular predicha de 86,21 kDa. El análisis filogenético indica que la peroxidasa de neutrófilos de rodaballo presenta una mayor similitud con la peroxidasa de eosinófilos de otras especies de peces y de mamíferos. Se determinó que la Mpo de rodaballo tiene varios dominios conservados: el péptido señal, el propéptido (118 aminoácidos) y las cadenas ligera (113 aminoácidos) y pesada (591 aminoácidos ). Otros sitios importantes para la regulación de la actividad MPO también están presentes en la Mpo de rodaballo, incluidas las cavidades distales del hemo I y II y el hemo proximal cavidades I y II. Varios residuos catalíticos, de enlace hemo y cisteína, un motivo de unión a Ca+2 y también ocho sitios potenciales de glucosilación unidos a N fueron identificados. El análisis efectuado por Western blot empleando un anticuerpo policlonal anti-Mpo reveló que la Mpo de rodaballo existe en su forma madura como un homodímero de aproximadamente 150 kDa en el riñón anterior, bazo, líquido peritoneal y suero, lo que indica que la proteína pierde el propéptido durante maduración. El gen de la mpo mostró mayor expresión constitutiva en el riñón anterior, branquia, glóbulos blancos y bazo, y menor en hígado, músculo, corazón y cerebro. Mediante inmunofluorescencia, se identificaron células compatibles con neutrófilos que contienen gránulos de Mpo en el riñón anterior, bazo y leucocitos de sangre. En un en prueba de estimulación in vitro, se aislaron leucocitos de riñón anterior y se estimularon con la Mpo de rodaballo purificada, obtenida mediante cromatografía de afinidad. La incubación de los HKL con la Mpo de rodaballo reguló positivamente las citocinas proinflamatorias tnfa, il12b e il17; la enzima proinflamatoria lox; el factor inhibidor de la migración de macrófagos (mmif) y los genes que codifican las integrinas CD11b y CD18. Esto sugiere que, además de su actividad microbicida, la Mpo puede actuar como mediador de la respuesta inmunitaria en peces. Capítulo 5 La vacunación se considera la mejor forma de controlar las enfermedades infecciosas en acuicultura. Sin embargo, la mayoría de los adyuvantes utilizados en la acuicultura, especialmente los adyuvantes oleosos, causan daños a los peces, provocando un retraso del crecimiento y efectos negativos en su bienestar. En este estudio se han desarrollado varios adyuvantes basados en los polisacáridos de origen natural carboximetilcelulosa, quitosano o ulvano: gel de ulvano, carboximetilcelulosa metacrilatada, ulvano metacrilatado, ulvano-quitosano a y ulvano-quitosano b. De estos, se seleccionaron tres formulaciones y se probaron en ratones y/o rodaballos: carboximetilcelulosa metacrilatada (CM), ulvano metacrilatado (UM) y ulvano-quitosano b (UQb). Los tres adyuvantes estimularon el estallido respiratorio de leucocitos de riñón anterior de rodaballo, aunque el ulvano-quitosano b fue el que mejor respuesta mostró. Además, se inmunizaron ratones y rodaballos y se analizó el perfil Th1/Th2 generado en ratones mediante ELISA, midiendo el nivel de IgG2a e IgG1 específicas. También se estudió la expresión temprana de los genes tbx21, gata3, ifng e il4, observándose una regulación positiva en todos los adyuvantes testados, a excepción del hidróxido de aluminio. Además, se inyectaron peces, a 0 y 30 días, con el adyuvante oleoso Montanide ISA 763 A VG y antígeno entero de P. dicentrarchi o el nuevo adyuvante ulvano-quitosano b (2 mg/pez) y antígeno particulado del ciliado. A los 30 días de la dosis de refuerzo, el nivel de IgM específica fue mayor en el grupo UQb. Por otra parte, se llevó a cabo una infección experimental, obteniéndose una protección similar con los dos adyuvantes, aunque el grupo UQb generó muchos menos daños en la cavidad peritoneal. El UQb es biodegradable y económico, e induce unos altos niveles de protección, provocando muchos menos daños que los adyuvantes oleosos. Todo esto hace de esta nueva vacuna una buena alternativa para combatir la escuticociliatosis en el rodaballo.