Análisis proteómico de la matriz extracelular de las biopelículas formadas por cándida albicans. Identificación de posibles determinantes de virulencia

Resumo

Candida albicans es un hongo patógeno oportunista capaz de producir graves infecciones sistémicas en individuos inmunocomprometidos. Entre los atributos biológicos que le confieren a C. albicans su potencial patogénico, la capacidad de formar biopelículas parece jugar un papel esencial. Las biopelículas son comunidades celulares altamente organizadas con una compleja estructura tridimensional, adheridas a un sustrato sólido (biológico o no biológico), en la que las células se encuentran embebidas en una matriz exocelular (ME) formada por polisacáridos, proteínas y otros componentes minoritarios. La ME juega un papel crítico en el mantenimiento de la integridad estructural de las biopelículas y en la protección de las células frente a factores externos adversos como el sistema inmunitario y/o el tratamiento con antimicrobianos. Por lo tanto, un mejor conocimiento a nivel molecular y funcional de los constituyentes mayoritarios de la ME podría ser esencial en el desarrollo de nuevas estrategias para el diagnóstico, Candida albicans es un hongo patógeno oportunista capaz de producir graves infecciones sistémicas en individuos inmunocomprometidos. Entre los atributos biológicos que le confieren a C. albicans su potencial patogénico, la capacidad de formar biopelículas parece jugar un papel esencial. Las biopelículas son comunidades celulares altamente organizadas con una compleja estructura tridimensional, adheridas a un sustrato sólido (biológico o no biológico), en la que las células se encuentran embebidas en una matriz exocelular (ME) formada por polisacáridos, proteínas y otros componentes minoritarios. La ME juega un papel crítico en el mantenimiento de la integridad estructural de las biopelículas y en la protección de las células frente a factores externos adversos como el sistema inmunitario y/o el tratamiento con antimicrobianos. Por lo tanto, un mejor conocimiento a nivel molecular y funcional de los constituyentes mayoritarios de la ME podría ser esencial en el desarrollo de nuevas estrategias para el diagnóstico, prevención y control de las candidiasis. La formación de biopelículas es un proceso biológico muy complejo durante el cual las células fúngicas deben establecer múltiples interacciones con el entorno ambiental. En este contexto, se ha descrito la presencia en C. albicans de una familia de proteínas que contienen un dominio formado por 8 cisteínas, denominado CFEM (common in several fungal extracellular membrane proteins), y que pueden actuar como receptores de superficie, en transducción de señales, y como moléculas de adhesión en las interacciones huésped-parásito. Nuestro grupo dispone de una colección de cepas con mutaciones en genes que codifica la síntesis de proteínas de la familia CFEM, en concreto los genes PGA10 (también designado como RBT51 y HPB1) y WAP1, que forman biopelículas muy frágiles y con poca capacidad de adherencia al sustrato frente a lo observado en la cepa parental CAI4-URA3. Por otro lado, dado que los resultados descritos en la bibliografía indican que el componente mayoritario presente en la ME de las biopelículas formadas por C. albicans son carbohidratos, también se consideró interesante determinar la capacidad de formar biopelículas de mutantes de este hongo deficientes en glicosilación. En concreto se estudiaron mutantes para los genes MNN9 y ALG5, que al igual que en el caso anterior formaron biopelículas muy frágiles y con poca capacidad de adherencia al sustrato. Las biopelículas de 48 h formadas por las cepas de C. albicans analizadas fueron tratadas con etanol al 60% durante 60 min. Los extractos etanólicos resultantes fueron concentrados mediante liofilización, valorándose su concentración proteica mediante el método de Bradford. Seguidamente se determinó el patrón polipeptídico asociado a cada extracto mediante electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida del 12% en la segunda dimensión (2D-PAGE). A partir de los diferentes electroforegramas obtenidos se seleccionaron 276 manchas proteicas (85 para la cepa parental; 138 para el mutante alg5¿; y 8, 19 y 26 para los mutantes pga10¿, mnn9¿ y wap1¿, respectivamente) para ser procesadas por MALDI/MALDI-TOF. Este análisis condujo a la caracterización de 114 polipéptidos, que correspondieron a 85 especies proteicas diferentes, lo que representó un 41,3% de manchas identificadas. De las 114 especies polipeptídicas identificadas, se detectaron 102 de ellas sistemáticamente en todos los electoforegramas, que determinan un perfil polipeptídico básico mayoritario, común para todas las muestras analizadas. El hecho de encontrar un perfil polipeptídico común asociado a todas las muestras analizadas, en donde están representadas la mayor parte (~ 90%) de las proteínas identificadas, sugeriría un papel funcional importante de las mismas en la biología de las biopelículas. De acuerdo con la clasificación en categorías funcionales GO, las proteínas identificadas se han agrupado de la siguiente manera: un 25,3% pertenecen a la categoría GO:0003476 (Función molecular), un 20% a la categoría GO:0016491 (Actividad oxidoreductasa), un 16,8% a la categoría GO:0016470 (Actividad transferasa), un 15,8% a la categoría GO:0016787 (Actividad hidrolasa), un 11,6% a la categoría GO:0005515 (Unión a proteínas), un 7,4% respectivamente a las categorías GO: 0016829 (Actividad liasa) y GO:0016853 (Actividad isomerasa), y el resto (un 16,1%) se han distribuido en otras 10 categorías funcionales GO. Más de un 98% de especies proteicas identificadas mostraron unos índices de hidropatía negativos, lo que es consustancial con el ambiente altamente hidrofílico de la ME, que podría definirse como un hidrogel. Por otro lado, mediante el algoritmo inmunoinformático POPI se pronosticó la inmunogenicidad para linfocitos TC y TH, observándose que un 74,1% de las proteínas presentes en la ME contienen péptidos débil o medianamente inmunogénicos en sus secuencias aminoacídicas. La predicción de presencia de péptido señal a partir de la información obtenida del análisis de las diferentes secuencias aminoacídicas con la base de datos del Signal IP 3.0 Server, puso de manifiesto que la mayoría de proteínas identificadas en el presente trabajo en los extractos de ME de las biopelículas carecen de péptido señal. Mediante la técnica del ¿cassette SAT1 flipper¿ se ha procedido a obtener un mutante nulo de C. albicans para la secuencia génica orf19.521 que codifica una proteína de 29 kDa que cuya función biológica es ligar IgE humana, por lo que podría estar relacionada con las afecciones de tipo alérgico que C. albicans puede causar en humanos. Esta proteína se detectó de forma consistente en diferentes manchas de los electroforegramas obtenidos a partir de todos los extractos de ME de biopelículas analizados, localizadas en rangos distintos de tamaño molecular, lo que sugiere que este polipéptido podría experimentar ciertas modificaciones post-traduccionales (interacciones covalentes con otras proteínas, niveles distintos de glicosilación y/o ubiquitinación, etc.) durante su síntesis, exportación e incorporación a la estructura de la matriz extracelular. La interrupción de una o las dos copias de la secuencia orf19.251 produjo una serie de efectos pleiotrópicos muy variados en el fenotipo de los respectivos mutantes hetero y homocigótico. En este contexto, la velocidad de crecimiento fue sensiblemente inferior en el caso de ambos mutantes respecto de la cepa control SC5314. Ambas cepas mutantes mostraron un incremento en la hidrofobicidad de la superficie celular que fue más acusado cuando las células se incubaron previamente en condiciones adecuadas para inducir la formación de tubos germinativos. Así mismo, se apreció un incremento importante tanto en la sensibilidad a diferentes sustancias que alteran el correcto ensamblaje de los componentes macromoleculares de la pared celular como al estrés osmótico. La mayor sensibilidad de las cepas mutantes a los agentes antifúngicos que actúan a nivel de la pared celular (Caspofungina) o de la membrana plasmática fúngica (Fluconazol y Anfotericina B) podría ser consecuencia, precisamente, de las alteraciones que aquellas poseen, aparentemente, en la estructura de la pared, lo que podría favorecer la accesibilidad de las drogas a las correspondientes dianas. Otro de los efectos asociados a la interrupción de una o las dos copias del orf19.251 se manifestó en forma de una alteración en la capacidad de formar biopelículas, ya que las dos cepas mutantes generaron biopelículas muy delgadas y frágiles, con escasa capacidad de adhesión al sustrato. Los mutantes hetero y homocigótico para el orf19.251 fueron avirulentos en ratones lo que también sugiere un papel importante de la proteína de 29 kDa en la virulencia de C. albicans. En conjunto, los resultados presentados en esta tesis amplían significativamente el conocimiento cualitativo sobre las proteínas presentes en la ME de las biopelículas formadas por C. albicans, y abren la puerta a investigaciones subsiguientes encaminadas a evaluar si tales proteínas pudieran ser blancos potenciales para el desarrollo de nuevos agentes y/o estrategias para el tratamiento y/o prevención de las infecciones causadas por este hongo mediante, por ejemplo, el diseño de vacunas para prevenir la formación de biopelículas, así como de técnicas para el diagnóstico serológico para la detección precoz de infecciones por C. albicans asociadas con la capacidad de formar estas comunidades biológicas.