Seguimiento epidemiológico y tipificación molecular de aislamientos multirresistentes de salmonella entérica serotipo typhimurium y serotipo rissen

Resumo

Salmonella enterica es uno de los patógenos zoonóticos transmitidos por alimentos de mayor relevancia en todo el mundo y la creciente aparición y dispersión de variantes resistentes a múltiples fármacos es un motivo adicional de preocupación. Los aislamientos bifásicos de S. Typhimurium (con fórmula antigénica 4,[5],12:i:12) y su variante monofásica (4,[5],12:i:-), resistentes a cuatro fármacos: ampicilina, estreptomicina, sulfonamidas y tetraciclinas, están ampliamente distribuidos en diversos países europeos, incluida España. Esta última se conoce como clon monofásico europeo. Dada su importancia, la primera parte de la tesis doctoral se centró en el estudio de aislamientos bifásicos tetrarresistentes determinando su incidencia en el Principado de Asturias durante el periodo 2008-2014, tanto en muestras clínicas como de origen agroalimentario. Se analizaron un total de 312 aislamientos de S. Typhimurium, de los cuales 254 (81%) procedían de muestras clínicas y los 58 (19%) restantes de muestras agroalimentarias. A lo largo del periodo indicado se detectaron un total de 202 aislamientos tetrarresistentes, representando el 66,4% y el 50% de los aislamientos de S. Typhimurium obtenidos de muestras clínicas y alimentos, respectivamente. Estos aislamientos se distribuyeron en 21 fagotipos (DT195, DT132, DT208, DT110, U311, U310, U302, DT10, DT12, DT120, DT18, DT22, DT274, DT296, DT18, DT2, DT99, DT7, DT138, DT193 y DT104). Coincidiendo con estudios previos, se comprobó la codificación de la tetrarresistencia por los genes blaTEM-1, strAB, sul2 y tet(B), de localización cromosómica, y se identificaron variantes asociadas a la pérdida de alguno de ellos o a la adquisición de otros nuevos (aadA1-like, aadA2, sul1, sul3, dfrA1-like, dfrA12). Considerando fenotipo y genes de resistencia se identificaron un total de 24 variantes. La tipificación molecular mediante XbaI-PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis) y MLVA (Multi-Locus Variable number tándem repeat Analysis) distribuyó los aislamientos en 56 y 41 perfiles, respectivamente. Los índices de diversidad de Simpson obtenidos fueron 0,893 y 0,955 para PFGE y MLVA respectivamente, por lo que ambos consiguen una buena diferenciación intraserotipo. En el análisis MLVA se encontró variabilidad en cuatro de los cinco loci analizados, con cuatro, ocho, catorce y cinco alelos para STTR9, STTR5, STTR6 y STTR3, respectivamente. Además, dos aislamientos tetrarresistentes fueron positivos para STTR10, localizado en el plásmido de virulencia pSLT específico del serotipo Typhimurium. También se llevó a cabo la secuenciación de los genomas de seis aislamientos representativos, utilizando la plataforma Illumina. Los aislamientos fueron escogidos en base a su fagotipo, perfil XbaI-PFGE y perfil MLVA. Los tamaños de los fragmentos de la librería estuvieron comprendidos entre 255 y 483 pb y se obtuvieron lecturas de 250 pb, “paired-end”. Las secuencias generadas fueron ensambladas con el programa informático VelvetOptimiser, obteniéndose entre 101 y 144 contigs para cinco aislamientos y 386 para el otro. Los tamaños de los genomas estuvieron comprendidos entre 4.913.443 pb y 4.983.230 pb y su contenido GC fue del 52.1% para cuatro aislamientos y del 52.2% para los dos restantes. La anotación preliminar de los genomas ensamblados se llevó a cabo utilizando el servidor RAST y la herramienta informática Prokka que pusieron de manifiesto una media de 4923 secuencias codificantes, 81 ARNt y 34 ARNr por genoma, . La búsqueda de genes de resistencia con herramientas como ResFinder, ARG-Annot o CARD, confirmó la presencia de blaTEM-1, strAB, sul2 y tet(B), previamente detectados por PCR convencional. Se identificaron, además, genes de resistencia a metales pesados (60) y fluoroquinolonas (4) . Los genes strAB y sul2 se localizaron en un mismo contig, ΔtnpRTn3 y blaTEM-1 en otro contig y el transposón Tn10 portador del gen tet(B) en un tercer contig, junto con el operón mer. El análisis del contenido plasmídico utilizando la herramienta web PlasmidFinder, reveló la presencia del replicón IncQ1 en todos los genomas. Dicho replicón se encontró en el mismo contig que los genes strAB y sul2, de acuerdo con la participación de plásmidos IncQ1 en la construcción de la región de resistencia cromosómica previamente demostrada para aislamientos monofásicos tetrarresistentes. Finalmente también se realizó una búsqueda de SNPs con el programa Progressive Mauve y las herramientas SAMTools y BAMTools, lo que permitió identificar una media de 640 SNPs por genoma, de los cuales el 37,3%, 41,5% y 18% fueron sinónimos, no sinónimos e intergénicos, respectivamente. Además se detectaron un total de 20 SNPs en todos los aislamientos que provocaron la aparición de un codón de parada. Estos resultados permitirán seleccionar SNPs para llevar a cabo estudios filogenéticos detallados, que completaran los ya realizados en esta tesis en base a 10 SNPs propuestos por otros autores. La detección de presencia o ausencia de esos SNPs mediante PCR a tiempo real, distribuyó 76, tres, uno y un aislamiento en los clusters III, IV, II y I respectivamente. Estos clusters fueron previamente establecidos por Pang et al (Journal of Clinical Microbiology, 50(3):727-73 : 2012) analizando una colección de aislamientos de S. Typhimurium con diferentes fagotipos. Los 15 aislamientos restantes no pudieron incluirse en ninguno de estos clusters. Finalmente, mediante el análisis MLST in silico de sus genomas, los seis aislamientos se asignaron a la secuencia tipo ST34, previamente asociada con el clon monofásico europeo. Por otro lado, estudios llevados a cabo por la EFSA (European Food Safety Agent) para controlar el impacto de la salmonelosis en salud humana y animal, destacaron al serotipo Rissen como el más frecuente en explotaciones porcinas españolas de cría y abasto. Estos hechos, junto con la detección de un posible brote causado por S. Rissen en el Principado de Asturias, dio lugar a la segunda parte de la tesis, la cual se centró en el estudio de los aislamientos S. Rissen recogidos en la comunidad durante el periodo comprendido entre 2008 y 2012. En el estudio se incluyó un total de 84 aislamientos, de los cuales 24 (29%) procedían de muestras clínicas, 23 (27%) de canales de cerdo y vacuno y 26 (31%) de alimentos de origen animal (hamburguesas, salchichas y chorizos elaborados con carne de cerdo o mezcla de cerdo y vacuno). Los 11 (13%) aislamientos restantes fueron responsables de un brote que ocurrió durante los meses de Septiembre y Octubre de 2011 (ocho procedentes de heces, dos de orina y uno de sangre). El 21.4% los aislamientos fueron sensibles a todos los agentes antimicrobianos ensayados, mientras que el 78,6% restante fueron resistentes a uno, dos, tres y cuatro o más (5, 6 o 7) agentes, considerándose estos últimos como multirresistentes. En total se identificaron 19 perfiles de resistencia, 12 de ellos multirresistentes. Los genes responsables de las resistencias fueron blaTEM-1 (ampicilina), cmlA (cloranfenicol), aadA1-like, aadA2, strAB (estreptomicina), sul1, sul2 y sul3 (sulfonamidas), tet(A) y tet(B) (tetraciclina), aphA1 (kanamicina), aac(3)-IV (apramicina) y dfrA1-like y dfrA12 (trimetoprim). Se identificaron, además, una gran variedad de elementos genéticos móviles implicados en la resistencia, en concreto, integrones tanto de clase 1 (de los tipos sul1 y sul3) como de clase 2, transposones (Tn3, Tn7, ΔTn10 y Tn1721) y numerosos plásmidos. La mayoría de los plásmidos detectados se adscribieron a los grupos de incompatibilidad IncF, IncR, IncI1-Iγ, IncY y ColE1 (estos últimos de pequeño tamaño) y todos, a excepción de tres, fueron conjugativos. Nueve de los aislamientos asociados al brote presentaron resistencia a tetraciclina conferida por el gen tet(A) de localización cromosómica y eran portadores de un plásmido ColE1 críptico de pequeño tamaño. De los aislamientos restantes, uno contenía un plásmido adicional de 45 kb (IncR) con los genes blaTEM-1, aadA1-like, aadA2, sul1 y dfrA12 de resistencia a ampicilina, estreptomicina, sulfonamidas and trimetoprim, mientras que el segundo presentaba un único plásmido críptico de 35 kb (grupo de incompatibilidad no determinado). Finalmente, la tipificación mediante XbaI-PFGE y BlnIPFGE, demostró que todos los aislamientos de S. Rissen analizados en esta tesis estaban estrechamente relacionados, apoyando la prevalencia de un clon que se transmite a los seres humanos a través de la cadena alimentaria y que ha causado casos esporádicos de gastroenteritis en el Principado de Asturias, además del brote. El estudio realizado, ha permitido conocer la incidencia, tipificar y caracterizar aislamientos de S. Typhimurium y S. Rissen, determinando las bases genéticas de la resistencia e identificando los tipos que han estado circulando en nuestra región durante los últimos años. El estudio es importante ya que las infecciones por S. enterica tienen una gran repercusión, no solo desde el punto de vista de salud pública, sino también por su impacto social y económico.