Protective properties of "Fusarium" and capsaicinoids against pathogens of solanaceous plants

Resumo

La identificación de compuestos de origen natural con capacidad antimicrobiana o que puedan inducir resistencia a patógenos en la planta, es una opción para desarrollar nuevos productos fitosanitarios. El uso de microorganismos beneficiosos, como las rizobacterias u hongos promotores del crecimiento vegetal (PGPR o PGPF), es también una alternativa de futuro a los productos clásicos. Estos microoganismos beneficiosos actúan mediante interacciones antagónicas con el patógeno o induciendo una respuesta de resistencia en la planta. La inducción de respuestas de defensa en la planta es una estrategia novedosa en agricultura y, hoy en día, se aplica poco debido a su escaso conocimiento para poder emplearla eficazmente. La resistencia inducida es un estado fisiológico en el que la planta posee una mayor resistencia a enfermedades. Esta respuesta es activada por estímulos ambientales específicos que pueden ser bióticos o abióticos. En general se han descrito tres tipos de resistencia inducida: la resistencia sistémica adquirida (SAR), la resistencia sistémica inducida (ISR) y la resistencia inducida por herbívoros y heridas. La activación de estas respuestas se encuentra bajo el control de una compleja regulación que asegura que los recursos de la planta se empleen de manera óptima. Estas complejas redes de señalización incluyen varias hormonas, entre las que destacan el ácido salicílico, el etileno y el ácido jasmónico. Otras hormonas, como pueden ser el ácido abscísico o las auxinas, pueden intervenir también en la regulación de las respuestas de defensa inducida. La SAR presenta una ruta de señalización en la que la hormona reguladora principal es el ácido salicílico, mientras que la ISR y la respuesta inducida por heridas están reguladas fundamentalmente por el ácido jasmónico y el etileno. El pimiento de Padrón (Capsicum annuum) es un cultivo de gran importancia económica en Galicia y que también se exporta a otras regiones de España y a algunos países Europeos. Una de las enfermedades que más incidencia tiene sobre este cultivo es la tristeza del pimiento causada por el hongo Verticillium dahliae. En este trabajo se han ensayado varios inductores bióticos y abióticos para reducir la incidencia de esta enfermedad en el pimiento de Padrón. También se han usado otros hongos patógenos (Phytophthora capsici y Botrytis cinerea) así como otra solanácea, el tomate, para poder establecer comparaciones. Como inductores abióticos se utilizaron dos capsicinoides: la capsicina y la N-vanillilnonanamida. Estos compuestos se encuentran de manera natural en los frutos de pimiento y se les ha atribuido una función de defensa frente a microorganismos patógenos. Los capsicinoides poseen una actividad microbiana de amplio espectro, basada en su capacidad para alterar la fluidez de la membrana plasmática al interaccionar con sus componentes. Además de estas propiedades antimicrobianas, los capsicinoides han sido muy estudiados en células de mamífero por sus propiedades apoptóticas. Los capsicinoides desencadenan la apoptosis en células animales mediante mecanismos que implican flujos de Ca2+, la generación de especies reactivas de oxigeno (ROS), MAP quinasas y la activación de caspasas. Los mecanismos por los que se desencadena la respuesta hipersensible en células vegetales también implican flujos de Ca2+, ROS, MAP quinasas y la activación de metacaspasas. Estas similitudes nos sugieren una hipotética analogía entre estos fenómenos. No se ha demostrado hasta la fecha que los capsicinoides sean capaces de inducir tales respuestas en células vegetales. Sin embargo, otras sustancias capaces de inducir ROS en células animales han demostrado ser capaces de inducir respuestas de defensa en células vegetales. En esta tesis también se han utilizado inductores bióticos. El hongo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) confiere protección frente a varios patógenos fúngicos de pimiento. Sin embargo, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici es un patógeno de tomate y por tanto no puede ser utilizado en campo. Existen dos alternativas para la aplicación práctica de Fusarium: el uso de elicitores derivados del hongo o el uso de cepas no patogénicas. En este trabajo se aplican las dos alternativas. Se obtuvo un extracto de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici y se aplicó como inductor. Y por otra parte, se ensayó la capacidad protectora de una cepa no patogénica, Fusarium oxysporum 47 (Fo47). Fo47 se aisló a partir de suelos supresivos en Francia. La microbiota de estos suelos reduce la incidencia de las enfermedades de las plantas que crecen en ellos. Esta reducción puede deberse a interacciones directas del patógeno con los microorganismos del suelo o a la activación de respuestas de defensa en la planta mediadas por los microorganismos del suelo. Previamente, otros autores han demostrado que es eficaz en la protección frente a patógenos fúngicos en diferentes cultivos pero no se ha comprobado su efecto en el pimiento. El mecanismo por el que Fo47 ejerce su protección incluye antagonismo con el patógeno mediante competición por nutrientes. Sin embargo, también se ha observado que Fo47 es capaz de inducir un efecto protector en la planta. Por ello se propone una combinación de antagonismo y resistencia inducida como modelo de la protección conferida por Fo47. METODOLOGÍA La inducción con N-vanillilnonanamida se realizó por perfusión de una solución del compuesto inductor en las hojas y por inmersión de las raíces en una suspensión del este compuesto. La inducción con el extracto de micelio de FOL se realizó por inmersión de las raíces en una suspensión del extracto. La inducción con Fo47 se llevo a cabo por inmersión de las raíces en una suspensión de conidios. La inoculación con Verticillium dahliae se realizó por inmersión de las raíces en una suspensión de conidios. La inoculación con Botrytis cinerea se llevo a cabo colocando gotas de una suspensión de conidios en las hojas. Phytophthora capsici se inoculó en la parte aérea y en la raíz. Para la inoculación radicular se añadió una suspensión de zoosporas al sustrato de las plantas. Para la inoculación foliar se colocaron discos de micelio en las hojas. La capacidad inhibitoria de la capsicina y la N-vanillylnonanamida sobre V. dahliae se comprobó en cultivo sobre medio sólido. Para comprobar los efectos antagónicos del agente de biocontrol Fo47 con los patógenos radiculares se realizó un ensayo de apareamiento en placa petri. Además se realizó un ensayo por microscopía confocal para observar interacciones sobre la superficie de la raíz entre V. dahliae y Fo47. Las actividades enzimáticas peroxidasa, quitinasa y ß-glucanasa se comprobaron por un método colorimétrico. Además se determinó mediante qPCR la expresión de genes de pimiento involucrados en la defensa. Los genes estudiados fueron una peroxidasa (CAPO1), una quitinasa (CACHI2), una ß-1,3-glucanasa (CABGLU), un proteína PR1 básica (CABPR1) y una sesquiterpeno ciclasa (CASC1) involucrada en la síntesis de la fitoalexina capsidiol. También se estudiaron los niveles de las fitohormonas ácido salicílico, glucósido de salicilato, jasmonoil-isoleucina, ácido 12-oxo-fitodienoico, ácido abscísico y los fenoles libres; ácido cafeico, ferúlico y clorogénico. Además, el perfil de expresión génica se estudió en plantas tratadas con Fo47 usando microarrays. CONCLUSIONES 1. La aplicación radicular de capsicina y N-vanillilnonanamida protege a pimiento frente a Verticillium dahliae, siendo mayor el efecto protector de la N-vanillilnonanamida, a pesar de que es menos tóxica que la capsicina. Además, la N-vanillilnonanamida induce la expresión de CASC1 (que codifica para una sesquiterpeno ciclasa), CABGLU (una ß-1,3-glucanasa) y CACHI2 (una quitinasa). La N-vanillilnonanamida protege al pimiento frente a Verticillium dahliae no solo por efecto antimicrobiano sino también por inducción de defensas en la planta. La aplicación foliar de N-vanillilnonanamida no protege a tomate cv. Pearson frente a Botrytis cinerea pero si protege a pimiento y al mutante de tomate Never ripe, deficiente en la percepción de etileno. Este hecho sugiere una regulación diferente de la resistencia inducida en pimiento y tomate. 2. La elicitación con un extracto de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici induce resistencia frente al hongo patógeno Botrytis cinerea en pimiento, pero no frente a Verticillium dahliae. El elicitor induce la expresión de los genes CASC1, CABPR1 (que codifica para una proteína PR1) y CACHI2. Sin embargo, el elicitor no altera los niveles de las enzimas quitinasa y peroxidasa. 3. Fo47 no presenta antagonismo con Phytophthora capsici en los ensayos de apareamiento en placa, pero induce protección en pimiento frente a este oomiceto en raíces y hoja, aunque solamente de manera transitoria en las hojas. Sin embargo, Fo47 no protege al pimiento frente a Botrytis cinerea. 4. Fusarium oxysporum Fo47 protege pimiento frente a Verticillium dahliae. Fo47 reduce el crecimiento de Verticillium dahliae cuando se aparean en placa petri y reduce la presencia en la superficie de la raíz en los ensayos con Fo47-GFP y V. dahliae-DsRED. Además, Fo47 induce en las raíces y en el tallo la expresión de CASC1, CABPR1 y CACHI2, en algunos casos directamente y en otros después de la inoculación con V. dahliae, siendo este fenómeno conocido como ¿priming¿. Sin embargo, no altera los niveles de las enzimas quitinasa y peroxidasa. En conjunto, el mecanismo de acción de Fo47 frente a Verticillium dahliae combina antagonismo e inducción de resistencia en la planta. 5. El tratamiento con ácido salicílico protege al pimiento frente a Verticillium dahliae. CASC1 es un gen que se induce durante la respuesta de Fo47 y además es activado por el ácido salicílico. Fo47 provoca cambios en los niveles de ácido salicílico, glucósido de salicilato, el precursor del ácido jasmónico OPDA y el conjugado jasmonoil-isoleucina. Estas hormonas parecen jugar un papel importante en la respuesta a Fo47. 6. Varios genes implicados en la biosíntesis y la señalización del etileno se expresaron de manera diferencial sobre todo en pimiento, pero también en tomate. Tres genes de la biosíntesis del ácido jasmónico cambiaron su expresión únicamente en tomate. Fo47 no protege al cv. Pearson de tomate frente a Verticillium dahliae, pero si protege al pimiento y al mutante de tomate deficiente en percepción de etileno Never ripe. La respuesta inducida por Fo47 en pimiento es diferente de la observada en tomate. 7. Fo47 desencadenó la expresión diferencial de otras rutas en pimiento: señalización de auxinas, ubiquitinización, el metabolismo del almidón y la sacarosa, procesos de endocitosis, la biosíntesis de la fenilalanina, la tirosina y el triptófano, y la biosíntesis de los fenilpropanoides. En relación a estas dos últimas rutas, se detectaron cambios en la composición de los fenoles en las plantas de pimiento tratadas con Fo47.