Análisis del sistema de glicosilación de proteínas en la levadura pichia anomala

Zusammenfassung

El objetivo general de este trabajo consistía en obtener datos que permitieran avanzar en el conocimiento de los factores que determinan el patrón de glicosilación de las glicoproteínas sintetizadas y secretadas por levaduras, especialmente en lo referente al grado de elongación de las cadenas externas de los oligosacáridos unidos a proteínas por enlaces N-glicosídicos. Básicamente se trataba de obtener información que ayudara a comprender las razones por las que algunas proteínas producidas por levaduras, (en particular, las sintetizadas por S. cerevisiae) se hiperglicosilan, con oligosacáridos formados por más de 50 unidades de azúcar, mientras que otras (sobre todo, las producidas por especies pertenecientes a otros géneros) sólo reciben oligosacáridos de cadena corta, y por qué otras razones, dentro de una misma proteína, en algunos oligosacáridos se produce la elongación de la cadena externa mientras que en otros no tiene lugar esta modificación. Esta cuestión resulta de gran relevancia, no sólo desde el punto de vista biológico básico sino, especialmente, en lo que se refiere al empleo de las levaduras como sistema para la producción de glicoproteínas combinantes, dados los inconvenientes que para su empleo como fármacos de uso humano tienen las proteínas hiperglicosiladas. Trabajos realizados previamente sobre la invertasa de P. anomala y sobre el gen PaINV1 que la codifica, y en particular los dedicados a la caracterización de la enzima heteróloga producida a partir de este gen cuando es introducido por transformación en S. cerevisiae llevaron a considerar que P. anomala, y su invertasa, podrían constituir un buen modelo para el estudio de las cuestiones antes referidas. El hecho de que la expresión del gen PaINV1 en un mutante suc2 de S. cerevisiae diera lugar a la producción por los transformantes de dos formas activas de invertasa hipoglicosiladas, con un grado de glicosilación incluso menor que el que presenta la enzima producida en su ambiente natural, en las células P. anomala, junto a la tendencia de S. cerevisiae para hiperglicosilar las proteínas que en ella se expresas a partir de genes heterólogos llevó a pensar en la posibilidad de que, al menos en el caso de la invertasa de P. anomala, el patrón de glicosilación estuviera determinado por la estructura primaria de la proteína, de tal modo que esta secuencia contendría una información que sólo permitiría construir oligosacáridos de cadena corta al sistema enzimático encargado de la N-glicosilación. Cuando se comparan las secuencias de aminoácidos de Inv1p y Suc2p se encuentra que uno de los secuones que sufren hiperglicosilación en Suc2p se encuentra conservado en Inv1p, este hecho junto con el alto grado de homología de ambas proteínas hacen plantearse. ¿Por qué la maquinaria de glicosilación de S. cerevisiae no consigue también añadir un oligosacárido de cadena larga en este secuón equivalente. Se consideró la posibilidad de que la configuración del secuón en la invertasa de P. anomala fuera el factor que determinase una accesibilidad limitada para las enzimas que forman el sistema de glicosilación de S. cerevisiae y, para comprobarlo, se modificó, mediante mutagénesis dirigida, la secuencia del secuón de la Asn1 43 y la de su entorno inmediato, en el gen PaINV1, hasta hacerla idéntica a la secuencia equivalente en el gen SUC2. Con estos cambios no se consiguió modificar sustancialmente el tamaño del oligosacárido que se une a este secuón en la invertasa heteróloga, producida por los transformantes de S. cerevisiae portadores de la versión modificada del gen PaINV1. Sin embargo, cuando se modificó la Ser144 (un aminoácido polar sin carga), situado en posición +2 del secuón de N-glicosilación, por un aminoácido con carga positiva, tal como la lisina o la histidina se produjo un alargamiento del oligosacárido unido a la esparragina adyacente en un número de manosas suficiente para considerar a este secuón como hiperglicosilado, mientras que su sustitución por un residuo aniónico (ácido glutámico) o por uno apolar aromático (fenilalanina) no favorece la hiperglicosilación. La conclusión general que se obtiene de estos resultados es que el alargamiento de la cadena externa de manosas probablemente está sujeto a limitaciones esféricas impuestas por la orientación del núcleo interno del oligosacárido. Sin embargo que los miembros del género Pichia, no sean capaces de hiperglicosilar proteínas, no puede explicarse con esta hipótesis. La explicación a este fenómeno no sólo podrá comprobarse cuando se haya logrado llevar a cabo la caracterización de los componentes de la maquinaria enzimática encargada de completar la etapa del proceso de glicosilación que tiene lugar en el aparato de Golgi. En la presente Tesis se ha iniciado el estudio del sistema enzimático que realiza esta función en P. anomala comprobándose que, en esta levadura, existen los ortólogos de los genes OCH1, MNN9 y VAN1. Los resultados han permitido comprobar que el gen PaMNN9 es capaz de complementar eficazmente una mutación que inactiva el gen ortólogo de S. cerevisiae y que su deleción en P. anomala hace que esta levadura adquiera un fenotipo similar al de los mutantes mnn9 de S. cerevisiae y que añada oligosacáridos aún más cortos de lo normal a su propia invertasa, todo lo cual parece indicar que la enzima PaMnn9p puede funcionar de igual modo que su homóloga en S. cerevisiae (Ballou et al., 1991; Dean, 1995). Resultados similares se han obtenido respecto al gen PaAVN1, del que también se ha comprobado que es capaz de complementar de modo eficiente el fenotipo pleiotrópico producido por una mutación van1 en S. cerevisiae y que el silenciamiento de su expresión en P. anomala (mediante un RNA de interferencia) también provoca en esta levadura un fenotipo similar. Estos datos parecen indicar que las actividades de las manosiltransferasas de la parte cis del Golgi son similares a las de S. cerevisiae, con lo que habrá que continuar con el análisis de todas las proteínas que participan en este proceso.