Response to multiple stressors in Iberian pine treestradeoffs between drought stress and resistance to herbivory

Resumo

Llamamos cambio global al conjunto de alteraciones de los procesos naturales de nuestro planeta que se están produciendo como consecuencia de la actividad humana. Dos de las consecuencias más relevantes del cambio global son la pérdida de biodiversidad y la crisis climática, también conocida como cambio climático. El cambio climático implica un incremento en las temperaturas y una alteración del régimen de las precipitaciones que pueden desencadenar en una mayor incidencia y severidad de la sequía y de los incendios. Como consecuencia del cambio global también se está registrando un incremento de las presiones bióticas sobre nuestros bosques debido a la expansión de plagas y patógenos a nuevos territorios. Además, ayudados por el cambio climático pero fundamentalmente como consecuencia de la globalización, los bosques de todo el planeta están amenazados por nuevas enfermedades y plagas exóticas, a las que nunca habían estado expuestos. La cuenca mediterránea es un área especialmente vulnerable al cambio climático, pues los modelos predicen para el 2100 un incremento en las temperaturas de +5 ºC y un descenso en las precipitaciones de -30 %, cambios que además están afectando a la extensión y severidad de las interacciones bióticas antagonistas. Las coníferas son especies de gran tamaño y longevidad, expuestas a una gran variedad de estreses bióticos y abióticos que habitualmente actúan simultáneamente. Dado que son especies sésiles, deben aclimatarse a esos cambios en su ambiente mediante plasticidad fenotípica, reajustando su fenotipo, su morfología y su fisiología a las nuevas circunstancias a lo largo de su vida. La plasticidad fenotípica es un efectivo mecanismo de ajuste a los cambios rápidos que supone el cambio global, pero podría no ser suficiente. A través de las generaciones, las poblaciones también pueden reajustar su fenotipo a las presiones selectivas ejercidas por el ambiente mediante respuestas evolutivas adaptativas. Las respuestas evolutivas adaptativas requieren que exista suficiente variación genética intraespecífica y que ésta sea heredable. Las respuestas adaptativas son lentas y requieren de suficiente tiempo para ser efectivas, más aún en especies con ciclos de vida largos y reproducción tardía. Además, un problema adicional es que es posible que los caracteres que proporcionan ventajas en un ambiente estén correlacionados genéticamente con otros caracteres de historia vital. Como consecuencia, las presiones selectivas que afectan a un carácter podrían implicar cambios en otros caracteres correlacionados a través de las generaciones. Los pinos que han evolucionado en ambientes mediterráneos han desarrollado una serie de estrategias morfológicas y fisiológicas para prevenir o tolerar el estrés hídrico. Los pinos son especies isohídricas, cuyo principal mecanismo para hacer frente a la sequía es un rápido cierre estomático cuando sobreviene el estrés hídrico. Con ello previenen la pérdida excesiva de agua a través de la transpiración evitando, así, la mortalidad por cavitación en el xilema. Esta estrategia, incrementa la eficiencia del uso del agua pero modifica la conductancia estomática al CO2. La eficiencia en el uso del agua se puede medir, como se ha realizado en esta tesis doctoral, mediante la relación entre los dos isótopos estables del C en los tejidos vegetales. El cierre estomático implica la inanición de carbono, pues paraliza la fotosíntesis. El carbono asimilado es el recurso para el crecimiento y la reproducción, pero también para la síntesis de compuestos defensivos en coníferas. Otra de las estrategias de los pinos mediterráneos contra la sequía es el incremento de la biomasa radical en detrimento de la biomasa aérea. Con ello aumentan la superficie de absorción de agua y reducen la superficie de transpiración. Además, pueden realizar ajustes osmóticos acumulando solutos específicos dentro de las células, como azúcares o aminoácidos, para prevenir la pérdida de turgencia de las mismas durante los periodos de escasez de agua. Todos estos cambios, tanto morfológicos como fisiológicos, requieren de una integración muy precisa de la percepción del estrés hídrico y de su señalización a otros tejidos para producir respuestas ajustadas y eficaces. El ácido abscísico (ABA) es una de las moléculas esenciales en la respuesta al estrés hídrico, siendo la responsable de inducir el cierre estomático. El déficit de agua también desencadena la síntesis de dehidrinas, unas proteínas que mantienen la estabilidad de la membrana y la protegen del daño oxidativo. Es de destacar que existe una gran variación entre y dentro de poblaciones en estas respuestas al estrés hídrico en los pinos mediterráneos. Los pinos también responden al estrés causado por las interacciones bióticas antagonistas reajustando su fenotipo. Como en general todo tipo de plantas, los pinos poseen defensas, tanto físicas (o anatómicas) como químicas, que repelen, detienen o matan a los agentes bióticos causantes del daño, o bien atraen a los enemigos naturales de los mismos. Las defensas físicas son componentes estructurales que previenen el daño causado por los agentes bióticos, impidiendo o dificultando su acción ejerciendo de barreras físicas. La defensa anatómica más importante de los pinos son los canales resiníferos, donde se produce y almacena la resina. Pero también presentan estructuras lignificadas y otras enriquecidas en cristales de oxalato de calcio que se distribuyen por la peridermis, córtex, floema y xilema. Por otro lado, entre las defensas químicas de los pinos se encuentran compuestos de diferente naturaleza (proteínas defensivas, enzimas, compuestos fenólicos, terpenos, etc.) que actúan como tóxicos, disuasorios o que interaccionan con la fisiología del agresor. Los compuestos químicos que conforman la resina son las defensas químicas más representativas de los pinos. La resina está compuesta mayormente por terpenos que se clasifican en volátiles (mono- y sesquiterpenos) y no volátiles (diterpenos y ácidos resínicos). Cuando se produce el daño y se expone la luz de los canales resiníferos, la resina fluye hacia el exterior a presión, la fracción volátil se evapora y la no volátil se oxida y polimeriza sellando el área dañada. Otro grupo de compuestos químicos defensivos son los compuestos fenólicos, que comprenden diversos tipos como los estilbenos, flavonoides, taninos y lignanos. Los compuestos fenólicos derivan de la fenilalanina y se sintetizan en las células polifenólicas del parénquima. En general, todas las defensas químicas de los pinos son compuestos carbonados costosos de producir. Como la energía que se invierte en la síntesis y almacenamiento de defensas químicas o en la producción de defensas anatómicas deja de estar disponible para otros usos, la inversión en compuestos defensivos puede comprometer otras funciones vitales con las que comparten los mismos recursos (como crecimiento y reproducción). En función de cuándo se producen las defensas en relación al daño, las estrategias defensivas de las plantas se diferencian en defensas constitutivas, siempre presentes, y defensas inducidas, producidas en respuesta al daño o a los estímulos bióticos. Esta última es una buena estrategia para el ahorro de recursos carbonados, quedando éstos disponibles para otras funciones vitales cuando no son requeridos para la producción de defensas en ausencia de daño. Para poder ajustar la inversión defensiva en función del riesgo biótico, los pinos han de ser capaces de percibir el daño y señalarlo a otras partes de la planta. La percepción de la agresión comienza con la activación de receptores de moléculas señalizadoras (conocidos como “Pattern Recognition Receptors”, PRR) liberadas por las células dañadas (“Damage associated molecular patterns”, DAMs) o/y de receptores de los propios agentes bióticos (herbívoros, HAMPs; patógenos, PAMPs; o microbios, MAMPs) en la superficie celular de las plantas. La señalización a lo largo de los tejidos de la planta comprende una serie de cascadas de respuesta donde el ácido salicílico (SA) y el jasmónico (JA), dos hormonas vegetales, juegan un papel esencial. El ácido salicílico es una hormona implicada en la respuesta a patógenos e insectos chupadores de floema. Juega un papel clave en la inducción de las proteínas de resistencia (PR) y en la resistencia sistémica adquirida (SAR) y la respuesta hipersensitiva (HR). El ácido jasmónico y sus derivados (como por ejemplo el JA-Ile), son las hormonas implicadas en desencadenar las respuestas contra insectos mordedores y contra patógenos necrótrofos mediante la inducción de la síntesis de defensas como terpenos y fenoles. La respuesta a los estreses bióticos es muy variable entre y dentro de especies. Las causas de esa variabilidad engloban tanto factores genéticos como ambientales. En relación a la variación ambiental, se han propuesto diversas teorías o hipótesis para predecir la inversión defensiva de las plantas. Por un lado, la teoría de la Defensa Óptima (OD) hipotetiza que las plantas que crecen en ambientes con recursos limitados van a defender sus tejidos de forma diferente, dependiendo de la probabilidad que tiene ese tejido de ser atacado y de los costes que suponen sobre la eficacia biológica (fitness) de la planta defender a ese tejido. Asociada a esta teoría, la Hipótesis de la Apariencia de las Plantas (PAH) postula que las plantas de gran tamaño, que hospedan a una gran diversidad de enemigos generalistas, tienen que desarrollar una mayor diversidad de defensas en comparación con aquellas que hospedan a organismos especialistas. La Hipótesis del balance Carbono: Nutrientes (CNB) plantea que la síntesis de compuestos químicos defensivos se puede predecir por la disponibilidad relativa de nutrientes, especialmente la relación C: N, lo que podría modular las prioridades fisiológicas de las plantas para el crecimiento o la defensa. La Hipótesis del Balance entre Diferenciación y Crecimiento (GDBH) postula que las compensaciones fisiológicas entre los costes de la síntesis de compuestos defensivos en relación con la tasa neta de asimilación, necesaria para el crecimiento, dependen de la disponibilidad de recursos. A niveles moderados de escasez de recursos, las plantas prefieren invertir más en compuestos defensivos en lugar de crecer. En un marco macro evolutivo más extendido, la Hipótesis de Disponibilidad de Recursos (RAH) predice que el coste relativo de la inversión en defensas depende de la tasa de crecimiento del organismo, esta última, adaptable al ambiente según la disponibilidad de recursos. Según esta teoría, se supone que las especies de ambientes con escasez de recursos presentarán tasas de crecimiento más bajas e invertirán más en defensas constitutivas. Durante las últimas décadas, muchos estudios han demostrado que la fenología, la ontogenia y la genética, aparte de las condiciones ambientales, han contribuido a la variación observada entre y dentro de especies para la resistencia y respuesta a los estreses bióticos. Como ya se ha mencionado, las funciones vitales comparten recursos carbonados. Esto puede dar lugar a compromisos o a una priorización entre ellas dependiendo de las condiciones ambientales. Por ejemplo, la falta de carbono, debido al cierre de estomas en respuesta al estrés por sequía, puede comprometer a otros caracteres de historia vital al reducirse la cantidad de recursos carbonados disponibles. Además, cuando actúan conjuntamente estreses de diferente naturaleza, se pueden producir conflictos en la percepción y señalización de dichos estreses. Se sabe que existen interferencias entre las diferentes vías de señalización hormonal, que podrían ser aditivas, sinérgicas o antagónicas. Por ejemplo, se conoce que el ABA actúa de forma sinérgica con el JA. Sin embargo, la mayoría de los estudios en este campo se realizaron con especies de plantas anuales o plantas modelo, desconociéndose la posible interacción entre el estrés por sequía y la herbivoría en especies forestales como los pinos. En la presente tesis doctoral las especies objeto de estudio fueron dos pinos ibéricos, el pino Marítimo, rodeno o piñeiro bravo (Pinus pinaster Ait.) y el pino carrasco o pino de Alepo (Pinus halepensis Mill.). El pino marítimo es una conífera de crecimiento rápido nativa del oeste de la cuenca mediterránea, donde tiene especial interés económico para la industria maderera y resinera. Las poblaciones naturales presentan una gran fragmentación como consecuencia de los cuellos de botella impuestos por los períodos glaciales y de los posteriores procesos migratorios post-glaciales hacia el norte desde los refugios glaciales aislados. Como resultado de esta fragmentación, de procesos de adaptación local y también de su elevada plasticidad fenotípica esta especie presenta una variación fenotípica relativamente grande a lo largo de su rango de distribución. El pino carrasco es una especie distribuida a lo largo de la cuenca mediterránea en ambientes de baja pero variable disponibilidad hídrica a los que se ha tenido que adaptar, por lo que es una especie muy tolerante a la sequía. P. halepensis habita en áreas propensas a incendios, y presenta una reproducción precoz y tendencia a la serotinia. Su madera no es de interés comercial, pero es una especie muy empleada en plantaciones para la restauración y conservación del suelo. El insecto modelo empleado en esta tesis doctoral, Hylobius abietis L., es un coleóptero curculiónido. Se distribuye por el norte y centro de Europa y Asia, siendo la Península Ibérica el límite sur de su rango de distribución. Los adultos son capaces de volar grandes distancias, más de 10 km, atraídos por los volátiles que desprenden las coníferas recién taladas. Una vez que alcanzan zonas adecuadas, los músculos del vuelo se debilitan y comienzan a reproducirse. Las hembras ponen sus huevos a mediados de primavera en las raíces de los árboles, y las larvas, que pasan por cuatro estadios larvarios, se desarrollan comiendo el floema aun fresco. A finales de verano, los adultos emergen de las cámaras de pupación y se alimentan de la corteza y floema de las plantas jóvenes que se establecen en los claros abiertos en la masa, anillándolas y causándoles fácilmente la muerte. Debido a la gran mortalidad que producen en plantaciones y regenerados naturales tras la corta se considera una plaga muy importante en centro y norte Europa. El daño que causan es muy variable, dependiendo de las condiciones ambientales (por ejemplo, se desarrollan mejor en condiciones cálidas y causan más daño a horas crepusculares que diurnas) y del tipo y calidad (nutrientes, estado hídrico, defensas) del hospedante. Las coníferas se defienden contra este curculiónido mediante la inducción de canales resiníferos traumáticos y la producción de resina. La susceptibilidad varía entre especies y se ha descrito variación genética intraespecífica en varias especies de coníferas (P. pinaster, P. radiata, P. abies) y entre poblaciones en P. pinaster. En base a la estrategia isohídrica que presentan los pinos mediterráneos para tolerar el estrés hídrico, y el hecho de que inviertan grandes cantidades de carbono en la síntesis de compuestos defensivos, las hipótesis que se plantean en esta Tesis Doctoral son: i) los factores abióticos que alteran la fotosíntesis, como pueden ser la falta de luz o el estrés hídrico, afectan a la resistencia efectiva de los pinos ibéricos contra sus enemigos bióticos, al impedir la síntesis de compuestos defensivos debido a la falta de carbono; ii) los compromisos entre el estrés hídrico y la herbivoría no sólo se deben a la escasez de recursos carbonados, sino a las posibles interacciones que puedan existir entre las rutas de señalización de ambos estreses; iii) el efecto del estrés hídrico en la resistencia y respuesta de los pinos a estreses bióticos es diferente entre poblaciones; iv) las poblaciones de pino evolucionan en respuesta a las presiones selectivas impuestas por el cambio global, pero las repuestas evolutivas también puede comprometer a otros caracteres de historia vital. En base a estas hipótesis los objetivos de la presente tesis son: i) explorar hasta qué punto las restricciones en la asimilación de carbono debidas a la falta de luz pueden comprometer las capacidades defensivas de P. pinaster en respuesta a H. abietis (Capítulo 1); ii) testar si la inanición de carbono debida al cierre estomático en condiciones de estrés hídrico compromete las capacidades defensivas de P. halepensis frente a H. abietis (Capítulo 2); iii) estudiar el efecto de diferentes niveles de estrés hídrico sobre la resistencia de P. pinaster a H. abietis, analizando hasta qué punto este efecto se debe a la falta de recursos carbonados para la síntesis de compuestos defensivos a la interacción entre rutas de señalización de ambos estreses, o a ambas (Capítulo 3); iv) en estos tres primeros capítulos se emplearon diferentes poblaciones de las dos especies de pino para testar si el diferente grado de adaptación al estrés hídrico entre poblaciones pudiera alterar los patrones de interacción entre la respuesta a la sequía y a la herbivoría; v) por último, estudiar tanto las respuestas directas como las correlacionadas a la selección por crecimiento y eficiencia del uso del agua en P. halepensis (Capítulo 4). Para evaluar estas hipótesis, en el primer capítulo se realizó un experimento manipulativo destinado a evaluar hasta qué punto la disponibilidad de luz afecta a la capacidad de los pinos de inducir defensas en respuesta a la herbivoría. Para ello, se sometieron tres poblaciones de P. pinaster (Galicia-Costa, Soria-Burgos y Marruecos) a seis días de herbivoría por H. abietis (dos niveles: herbivoría y control) y a tratamientos cruzados de luz/oscuridad aplicados independientemente en planta y/o insecto (este último, encerrado en una caja en la parte central del tallo) mediante un diseño factorial. Transcurrido este tiempo, se cosecharon las plantas y se determinó el área dañada y la concentración de resina no volátil. Los resultados mostraron que el curculiónido causó mayor daño en condiciones de oscuridad y, además, cuando el daño fue mayor, la ausencia de luz afectó negativamente a la inducibilidad de resina por parte de la planta. Los resultados sugieren que la limitación de la disponibilidad de carbohidratos recién asimilados que impone la falta de luz sobre la planta afecta a la capacidad de los pinos de responder a la herbivoría del insecto produciendo nuevas defensas inducidas. En el segundo capítulo, se sometieron tres poblaciones contrastadas de P. halepensis (Benamaurel, Benicàsim y Cabanelles) a tres niveles de estrés hídrico (control, moderado y severo) durante cuatro meses. Posteriormente, se expusieron al herbívoro H. abietis durante cuatro días, siguiendo un diseño factorial. Transcurrido ese periodo, se analizó el potencial hídrico, la abundancia del isótopo pesado del carbono (δ13C), la concentración de carbohidratos, así como el daño causado por el herbívoro y la concentración constitutiva e inducida de compuestos defensivos. El daño causado por el insecto se vio afectado por el estrés hídrico, siendo éste un 75 % mayor en plantas sometidas a estrés hídrico moderado, volviendo a los mismos niveles que los observados en las plantas control (sin estrés hídrico) en el estrés severo. Las respuestas inducidas se vieron afectadas por la sequía. La inducibilidad de los compuestos fenólicos disminuyó con el estrés hídrico y la de los diterpenos fue mayor en estrés hídrico moderado, el nivel de estrés hídrico en el que el daño fue mayor. Además, se encontró un efecto significativo de la interacción sequía × herbivoría en el perfil de los terpenos. Los resultados confirman que la disponibilidad de agua es un importante modulador de las capacidades defensivas de las plántulas de pino frente a insectos herbívoros. En el tercer capítulo, se sometieron tres poblaciones de P. pinaster de régimen hídrico contrastado (San Ciprián, Coca y Oria) a tres niveles de estrés hídrico: control, moderado y severo, durante cuatro meses. Transcurrido ese tiempo, se expusieron al herbívoro H. abietis durante cinco días en un diseño factorial. Además de los caracteres ecofisiológicos analizados en el segundo capítulo para P. halepensis, también se analizó la concentración de hormonas y la expresión de genes implicados en la regulación de ambos estreses. En contra de lo esperado, los resultados obtenidos mostraron un incremento de la resistencia al insecto proporcional a la severidad del estrés hídrico. Además, apenas se observó un efecto del estrés hídrico sobre la inducibilidad de los compuestos defensivos. Sin embargo, en este capítulo, el JA-Ile, un derivado del jasmonato responsable del desencadenamiento de las respuestas defensivas inducidas, incrementó su concentración en respuesta al tratamiento de herbivoría, siendo esta respuesta mucho mayor cuanto mayor es el estrés hídrico, y por tanto mayor el incremento del ABA (hormona responsable de las repuestas al estrés hídrico). Los resultados sugieren una interacción positiva entre las rutas de señalamiento a ambos estreses (crosstalk) en las que ambas hormonas actúan sinérgicamente. En los tres capítulos anteriores, el efecto de la interacción entre el estrés abiótico y biótico fue muy consistente entre las poblaciones testadas para todos los caracteres analizados, no encontrándose variación genética relevante en la plasticidad de la interacción entre ambos estreses. Por último, para comprobar la cuarta hipótesis y conocer si existen respuestas directas y correlacionadas a las presiones de selección asociadas al cambio global, se seleccionaron árboles en una población parental de P. halepenesis por la eficiencia del uso del agua (iWUE) y por crecimiento, comparando su descendencia con aquella procedente de árboles elegidos al azar en esa misma población parental. La progenie se estableció en dos ambientes contrastados (uno más favorable que el otro en lo que a condiciones hídricas y nutritivas edáficas se refiere). Los ensayos de progenie se establecieron mediante un diseño aumentado que no sólo permite comparar los distintos grupos de selección (iWUE, Crecimiento y control), sino que también incluye una estructura familiar para estima de parámetros genéticos. Este diseño permitió estimar la heredabilidad y las respuestas directas para iWUE y el crecimiento, así como las respuestas correlacionadas para otros caracteres de historia vital mediante distintas aproximaciones de genética cuantitativa. Los resultados mostraron una fuerte respuesta a la selección para δ13C (indicador de iWUE) y una elevada heredabilidad para dicho carácter, si bien no se encontró variación genética aditiva entre las familias de medios hermanos. Por el contrario, el crecimiento sí presentó una variación significativa entre medios hermanos, pero no se encontró respuesta a la selección para este carácter. Las respuestas correlacionadas a la selección y las correlaciones genéticas entre otros caracteres de historia vital no fueron significativas, excepto una correlación positiva entre el crecimiento y los compuestos defensivos. Los resultados indican que las poblaciones de pino carrasco tienen capacidad de responder adaptativamente a las presiones de selección impuestas por el cambio global (aumento de sequía) y que estas respuestas tienen poca repercusión sobre otros caracteres de historia vital, al menos a edades tempranas. En resumen, los resultados obtenidos en la presente tesis indican que la sequía puede modificar la resistencia y la capacidad de respuesta de los pinos ibéricos a insectos mordedores de floema. Estos efectos están mediados por una combinación de una menor disponibilidad de recursos carbonados para la síntesis de defensas químicas y las interacciones existentes entre las rutas de señalización hormonal que regulan las respuestas de los pinos a ambos estreses. Además, hemos demostrado, mediante un experimento de selección, que la eficiencia en el uso del agua es un carácter suficientemente variable y heredable como para incrementar la iWUE a través de las generaciones futuras en respuesta a una presión de selección por sequía. No hemos encontrado evidencias de que esta capacidad de evolución adaptativa comprometa otros caracteres de historia vital como su capacidad de crecimiento y la concentración de defensas constitutivas. Aunque aún queda mucho trabajo por hacer, estos hallazgos arrojan luz en el conocimiento del comportamiento de los pinos mediterráneos en respuesta a cambios en su ambiente abiótico y biótico, y podrían ser útiles para optimizar herramientas de gestión forestal adaptativa en el contexto impuesto por el cambio global.