Efecto de los aminoácidos comunes sobre la inactivación de la nucleótido pirofosfatasa por el quelante de metales edtaevidencia de un cambio conformacional debido a los aminoácidos libres

Resumo

Las nucleótido-pirofosfatasas/fosfodiesterasas (NPP/PDE) son enzimas que hidrolizan derivados fosfoanhidrido y fosfodiéster de nucleósido 5'-monofosfatos (NMP), dando NMP como producto. Son ectoenzimas de membranas que pueden presentar también formas solubles. Su función biológica no se conoce con exactitud, aunque se les atribuyen diversos papeles fisiológicos y patogénicos relacionados con el recambio extracelular de derivados nucleotídicos, generación de pirofosfato extracelular, inhibición de la autofosforilación del receptor de insulina y aspectos de la motilidad e invasividad de células tumorales . No se conocen mecanismos fisiológicos de regulación de la actividad enzimática de las NPP/PDE. En esta tesis se ha investigado el efecto que producen los aminoácidos sobre la inactivación de la NPP/PDE de hígado de rata por bajas concentraciones del quelante de metales EDTA, que resultó ser un proceso dependiente del tiempo, bloqueado por el sustrato 4-nitrofenil-dTMP. La inactivación siguió una cinética de primer orden respecto a la concentración de NPP/PDE activa. Medidas de la actividad enzimática residual permitieron calcular la constante cinética aparente de inactivación (Ki(ap)). La sensibilidad al EDTA se ha empleado como una forma de sondear la conformación de la enzima. El efecto del EDTA fue potenciado por alfa-aminoácidos libres a concentraciones que, en ausenxia del quelante, no afectaban a la actividad enzimática. Todos los aninoácidos probados actuaron como aceleradores de inactivación por EDTA, aunque lo hicieron con distintas eficacias, estimadas en forma de factores de aceleración (cociente de los valores de ki(ap) obtenidos en presencia y en ausencia de aminoácidos) o de incrementos (porcentaje de aumentar del valor de ki(ap)). Experimentos hechos con compuestos cuya estructura difería de los alfa-aminoácidos en diversos aspectos indicaron que la presencia de los grupos alfa-amino y