Ontogenia y regeneración en la retina de pecesestudio comparado y experimental

Zusammenfassung

La retina es probablemente la región del sistema nervioso más empleada para el estudio de los mecanismos implicados en la determinación del destino celular puesto que contiene un número limitado de tipos celulares que se encuentran organizados en capas bien definidas. Su accesibilidad a la hora de manipularla y de someterla a condiciones experimentales constituye una ventaja adicional. Por otra parte, la retina de teleósteos se ha convertido en un modelo de enorme importancia para la realización de estudios de neurodegeneración y regeneración debido a que tras la aplicación de técnicas lesivas que provocan la degeneración de uno o más tipos celulares, dichas células regeneran, restaurándose la histología existente antes de la lesión y restableciéndose la función visual en un breve espacio de tiempo. A pesar de todo ello, los mecanismos de morfogénesis e histogénesis del sistema visual así como los estudios de neurodegeneración están descritos en muy pocas especies de teleósteos. La gran diversidad existente en el grupo de los peces demanda la realización estudios comparados para dichos procesos. Así, la mayoría de estos estudios se ha centrado en peces óseos de desarrollo precocial y de hábitos diurnos. Se ha demostrado que factores físicos como la luz pueden influir directamente sobre la composición celular de la retina. El hábitat en el que se desenvuelven los peces puede variar desde las altas intensidades lumínicas que reciben los peces de arrecifes coralinos hasta la ausencia total de luz en la que viven las especies abisales. Por tanto, seleccionar especies que habiten en diferentes ambientes puede aportar datos relevantes para comparar con los ya existentes. Los objetivos del presente estudio han sido, por un lado, analizar y comparar el proceso de ontogenia de la retina de tres especies diferentes a las comúnmente usadas en los estudios de biología del desarrollo, como son la tenca (Tinca tinca), el lenguado senegalés (Solea senegalensis) y la pintarroja (Scyliorhinus canicula). Por otro lado, en el presente trabajo también se pretende analizar, en un modelo de teleósteo silvestre con retina pigmentada, como es la tenca, la degeneración de los fotorreceptores, la respuesta fagocítica que se desencadena en el tejido para la eliminación de los restos generados así como las poblaciones celulares implicadas en la regeneración del daño inducido en la retina. La tenca es una especie de enorme arraigo en la acuicultura de Extremadura y aunque existen numerosos textos que describen aspectos generales de la biología y ecología de la especie, estudios más detallados y específicos de otros procesos biológicos pueden contribuir a un mejor conocimiento de la misma. Además, gracias a la disponibilidad de individuos, puede ser candidata a tomar como un modelo de carácter general en nuestro laboratorio. Por otro lado, estudios de retinogénesis en pleuronectiformes o peces planos como el lenguado senegalés son muy escasos. Lo mismo sucede en los condrictios como la pintarroja, los cuales además, por su posición filogenética, constituyen piezas clave que pueden ayudar a dilucidar la evolución de la retinogénesis en los vertebrados. Utilizando como modelo las tres especies anteriormente citadas, dos osteíctios altriciales (la tenca y el lenguado senegalés) y un condrictio precocial (la pintarroja), todos ellos adaptados a ambientes con una escasa intensidad de luz, se pretende llevar a cabo un estudio de neurobiología del desarrollo comparado utilizando como modelo la retina de dichas especies. Se ha realizado una descripción detallada de diferentes aspectos relacionados con la ontogenia de esta región del sistema visual en las tres especies anteriormente citadas. Para ello se han empleado, además de técnicas de histología básica que nos han permitido seguir diferentes aspectos de la histogénesis del mismo, técnicas inmunohistoquímicas con diferentes anticuerpos que identifican la práctica totalidad de las poblaciones celulares de la retina de vertebrados, incluso en diferentes momentos de su maduración. Para monitorizar el cese de la actividad proliferativa se han utilizado varios anticuerpos. Por un lado, el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), un marcador endógeno que identifica células en fase S, y por otro lado, el anticuerpo anti-fosfohistona H3 (pHisH3) que identifica un antígeno que se expresa durante la mitosis. Además se ha empleado anticuerpos frente a una proteína presente en la membrana de la vesículas sinápticas (SV2), con el objetivo de seguir el inicio de las sinapsis funcionales en las capas plexiformes. Finalmente, debido a que una de ellas es un pleuronéctido, con el uso de las mismas técnicas se ha comprobado la plasticidad de la retina de estos individuos durante el proceso de metamorfosis postnatal. Nuestros resultados demuestran que la diferenciación histológica y neuronal de la retina de tenca y lenguado, ocurre tras la eclosión en un breve espacio de tiempo. En la tenca, este proceso tiene lugar durante los tres primeros días después de la eclosión, mientras que en el lenguado la diferenciación de la retina se extiende durante los cinco o seis primeros días de vida. Con los marcadores utilizados, se comprueba que en ambas especies las células ganglionares son las primeras que se diferencian en el mismo día de la eclosión mientras que la glia de Müuler es el último tipo celular detectado. Por otro lado, los resultados demuestran que la pintarroja representa un modelo excepcional para abordar estudios de ontogenia retiniana, ya que se trata de un elasmobranquio precocial con un desarrollo embrionario muy lento. Con las técnicas empleadas se observa que el proceso de diferenciación celular de la retina en esta especie ocurre entre el estadio embrionario 28 y el estadio 33, presentando una retina plenamente diferenciada en el momento de la eclosión. Por lo tanto, el proceso de diferenciación se extiende durante aproximadamente 70-80 días. Al igual que en la tenca y el lenguado, son las células ganglionares las primeras que se diferencian en el Est 28. En esta especie se hace patente un claro gradiente vitreo-escleral de diferenciación neuronal, donde las últimas neuronas que se diferencian son los fotorreceptores. Al igual que ocurría en la tenca y el lenguado la glia de Müller es el último tipo celular detectado. Por otro lado, la retina de tenca puede constituir un modelo experimental de estudio en procesos de neurodegeneración inducida. A pesar de tratarse de una especie silvestre pigmentada, pensamos que el hecho de que se desenvuelva en ambientes oscuros puede hacerla más sensible a estímulos de alta intensidad de luz. Por ello, en el Capítulo II del presente trabajo se ha comprobado los efectos de una alta intensidad de luz sobre la retina de esta especie en individuos larvarios y juveniles, lo que ha permitido comprobar si la susceptibilidad de los fotorreceptores a este tipo de estímulos varía con la edad. Finalmente, se ha analizado el comportamiento del resto de poblaciones celulares de la retina, atendiendo principalmente al de las poblaciones de células fagocíticas involucradas en la eliminación de los restos celulares originados, así como la caracterización de las células madre proliferativas que recomponen la pérdida de las células que degeneran. Todo ello ha sido estudiado mediante el empleo de técnicas histológicas, inmunohistoquímicas e histoquímicas. Nuestros resultados ponen de manifiesto que durante la exposición prolongada a una alta intensidad de luz en larvas y en individuos juveniles de tenca silvestres pigmentados, únicamente se aprecian signos de degeneración en los fotorreceptores de la retina larvaria, localizada exclusivamente en la capa nuclear externa (CNE) de la misma. Además, la fagocitosis de los restos de los fotorreceptores generados durante la muerte celular inducida es llevada a cabo por las células de Müller desde el inicio del periodo de exposición a luz intensa, aunque su actividad fagocítica decae paulatinamente durante el transcurso del mismo. La degeneración de los fotorreceptores causa la activación, proliferación y migración vítreo-escleral de la microglía residente de la retina, por lo que la respuesta de este tipo celular frente al proceso degenerativo puede considerarse como retardada. Este hecho puede explicar la progresiva disminución en el número de células de Müller con capacidad fagocítica a medida que avanza el tratamiento.