Papel de genes de recombinación homóloga en la estabilidad genómica y reparación de daño al DNA en "Candida albicans”

Resumo

Introducción Cada vez hay más evidencias que muestran que, durante el proceso de infección, el éxito del organismo depende en gran medida de su capacidad para adaptarse a los diferentes nichos en el huésped humano a través de cambios genéticos, principalmente por mutaciones puntuales, translocaciones, pérdida de heterozigosidad (LOH) y aneuploidías (Ford et al., 2015). En las células humanas, estas alteraciones acompañan o preceden cáncer, pero en C. albicans no sólo son toleradas (Bouchonville et al., 2009), sino que se utilizan como un mecanismo de adaptación al estrés ambiental, incluyendo la presencia de fármacos antifúngicos. La presencia de LOH y aneuploidías son comunes entre los aislados clínicos. Es importante destacar que las cepas resistentes a azoles que llevan LOH y aneuploidías exhiben una alto fitness, incluso en ausencia de la droga, lo que sugiere que las alteraciones genéticas subyacentes no afectan o incluso pueden mejorar la tasa de crecimiento (Selmecki et al., 2008). Otros estreses, como el peróxido de hidrógeno (H2O2) inducen LOH y pérdida de cromosoma (CL) (Forche et al., 2011). En pacientes con cáncer, las células endógenas de C. albicans están sometidas a estreses específicos derivados de tratamientos con radiación ionizante (IR) y de la administración de drogas que causan DSB (bleomicina -BLM-) o interfieren con la replicación del DNA (camptotecina -CPT-, o temozolomida -TMZ-, un agente alquilante). Tenemos evidencias de que la reparación de los daños causados en el DNA resultan en cepas que llevan LOH y GCR. Desarrollo teórico Los resultados de la tesis están agrupados en tres capítulos: 1. En C. albicans la mayoría de las repeticiones son cortas, pero otras como las presentes en las proteínas ALS alcanzan los 108 pb. Debido al alto número de ORFs que llevan repeticiones en C. albicans, hemos tratado de identificar vías que conducen a la modificación de repeticiones directas y analizar el papel de Rad51, Rad52 y Rad59 en la selección de las vías de recombinación que participan en esos procesos. Estos procesos pueden alterar el número de repeticiones y por lo tanto generar nuevos alelos de una ORF específica; además, la recombinación entre las repeticiones de dos genes de la misma familia (por ejemplo, ALS) podría conducir a la formación de quimeras dotadas con propiedades que pueden ser ventajosas para la supervivencia en el huésped (Zhao et al., 2011). 2. Además del MMS, un número de agentes endógenos y ambientales incluyendo drogas frente al cáncer pueden causar daño por metilación (Drablos et al., 2004; Sedgwick et al., 2007) y afectar a la viabilidad y virulencia de patógenos comensales oportunistas como C. albicans. Nuestro grupo de investigación ha demostrado que células rad52-¿¿ y, en menor medida, rad51-¿¿ de C. albicans exhiben fenotipos acusados, incluyendo disminución de la tasa de crecimiento, morfología filamentosa y aumento en la sensibilidad de varios agentes que dañan al DNA como MMS y luz UV (Andaluz et al., 2006; García-Prieto et al., 2010; Bellido et al., 2015). En este capítulo, se muestra que no hay sinergia entre las mutaciones rad59 y rad51 o rad52 en la reparación de daños en el DNA provocados por MMS y UV. Con el fin de revelar posibles características de la maquinaria de reparación del DNA de C. albicans, la cepa silvestre y mutantes HR del diploide W303 de S. cerevisiae se han analizado en paralelo. También hemos determinado daños por metilación en C. albicans, aprovechando las roturas secundarias y la fragmentación cromosómica que originan durante la preparación de las muestras para PFGE a 55ºC. Finalmente, se ha analizado el papel que juegan los genes de HR en la prevención y recuperación de las roturas dependientes de calor inducidas por MMS, tanto en células en división como en células paradas en G2. 3. En el último capítulo, hemos analizado el efecto citotóxico causado por CPT tanto en C. albicans como en un diploide de S. cerevisiae y el papel de HR en la reparación de las lesiones inducidas. Hemos encontrado que para concentraciones bajas de CPT y tratamientos crónicos, HR juega un papel más importante en la supervivencia en S. cerevisiae en comparación con C. albicans. En presencia de 40 µg/ml de CPT no afectó el crecimiento de la cepa silvestre de C. albicans, pero inhibió el de los mutantes rad51 y causó muerte progresiva en células rad52 cuya supervivencia se redujo al 25% en 8 horas, sin causar niveles detectables de la fragmentación del DNA. En los tratamientos de CPT agudos, la capacidad de supervivencia de los mutantes rad51 y rad52 alcanzó una meseta a 5 µg/ml, lo que sugiere la saturación de los transportadores. Conclusiones 1. La inactivación del marcador URA3 en la construcción hisG-URA3-hisG, en la cepa silvestre, ocurrió con una tasa de 1,572 x 10-5 por división celular. Tuvo lugar mayoritariamente por deleción (pérdida del marcador URA3 y una copia de la repetición hisG). La recombinación con el homólogo fue minoritaria y no se observaron eventos CL y CT. 2. La tasa de inactivación del marcador URA3 en cada mutante de recombinación simple (rad51, rad52 y rad59) fue similar a la de la cepa parental. Sólo se incrementó significativamente dicha tasa en los dobles mutantes rad59-¿¿ rad52-¿¿ y lig4-¿¿ rad52-¿¿, lo que sugiere que Rad59p y Lig4p son deletéreos para la generación de supervivientes en ausencia de RAD52. 3. La ausencia de Rad59p no alteró el porcentaje de los procesos de pérdida del marcador (deleción versus recombinación entre homólogos -IH-), mientras que la ausencia de Rad51p anuló los eventos IH que fueron canalizados a CL y CT, aunque no alteró significativamente la frecuencia de deleciones intracromosómicas. Estos resultados sugieren que la deleción en el silvestre ocurrió por SSA y no por crossover intracromátida o por recombinación desigual entre cromátidas hermanas. CT fue el evento principal que originó segregantes Uri¿ en ausencia de Rad52p, y se observó CL cuando el test cromosoma fue el cromosoma dispensable Chr6b; mientras que cuando el test cromosoma fue Chr6a, no se observó CL y CT aumentó significativamente. 4. Nuestros ensayos no seleccionaron segregantes 5FOAR que llevan un C6F centromérico con un URA3 funcional. Dado que el Chr6 tiene un tamaño de 1,032 Mb y que la distancia entre RAD52 y el telómero izquierdo es de ¿ 95 Kb, el tamaño máximo esperado para un C6F fue por lo general inferior al Chr7 (935 Kb). 5. Hemos analizado la sensibilidad de C. albicans y sus mutantes HR a concentraciones de MMS que no producen fragmentación cromosómica en las células de C. albicans in vivo a juzgar por el análisis de los cariotipos PFGE, siempre y cuando las incubaciones de los plugs se realizaran a 30ºC. 6. El mutante Carad52-¿¿ fue mucho más sensible a MMS que los mutantes Carad51-¿¿ o Carad51-¿¿ rad59-¿¿, sugiriendo que las vías dependientes de Rad52 que usan otros factores distintos de Rad51 o Rad59 son operativas en C. albicans. Sin embargo, para luz UV, las sensibilidades de mutantes Carad51-¿¿ y Carad52-¿¿ eran indistinguibles lo que sugiere que la mayoría de la reparación dependiente de HR de lesiones UV en C. albicans utiliza mecanismos de invasión de banda. 7. Tanto en tratamientos agudos como crónicos de MMS, las vías de HR dependientes de Rad52 y, en mayor medida, de Rad51 parecen jugar un papel ligeramente más importante en la recuperación de lesiones por MMS en C. albicans en comparación con S. cerevisiae, independientemente de la presencia o ausencia de Rad59. 8. En células en crecimiento activo de C. albicans, la reparación de HDB causados por MMS fue relativamente rápida (1-2 h) y fuertemente dependiente de HR. No sólo Rad59 aceleró la restitución de la escalera cromosómica, sino que tanto Rad51 como, en mayor medida, Rad52 eran necesarios tanto para la supervivencia de un tratamiento agudo de MMS (0,05% MMS, 30 min en PBS), como para la reparación de HDBs durante la recuperación en ausencia de MMS. La reparación de lesiones provocadas por MMS en células en crecimiento requiere de la existencia de un metabolismo activo, ya que las células silvestres mantenidas en PBS no restauraron los HDBs, mientras que las incubadas en YEPD sí lo hicieron. 9. La supervivencia a MMS de células paradas en G2/M de C. albicans fue similar a la mostrada por células proliferativas de la misma cepa, si bien la reparación de HDBs tras la eliminación de MMS se produjo más lentamente y fue independiente de la presencia o ausencia de Rad59. En esta reparación, Rad51 fue prescindible, sino inhibitorio, mientras que Rad52 resultó esencial, lo que sugiere que la reparación involucra la actividad de apareamiento de Rad52 en lugar de invasión de banda dependiente de Rad51. 10. Los mutantes rad51 y rad52 de S. cerevisiae fueron significativamente más sensibles que sus homólogos de C. albicans a las concentraciones de CPT utilizadas, aunque las cepas silvestres y los mutantes rad59-¿¿ fueran igualmente resistentes. 11. La muerte por CPT en C. albicans requiere no sólo defectos en HR, sino también la exposición continua y prolongada a la droga, ya que en experimentos crónicos (y en ausencia de Rad52p), el 100% de las células murieron a concentraciones de 2,5 µg/ml, mientras que en tratamientos agudos (a concentraciones de CPT 15 veces superior) no mataron a más del 66% de la población. Esto sugiere que la concentración intracelular eficaz para causar la muerte no se alcanza, bien por el alto número de células o porque CPT es degradada parcialmente. El hecho de que concentraciones subletales no mataran a las células en ausencia de Rad51 o Rad52 sugiere que rutas de reparación independientes de Rad51 y Rad52 pueden reparar lesiones con la condición de que no sean muy abundantes y/o no se produzcan DSBs. En este escenario, sugerimos que altas concentraciones de CPT impiden que se complete la replicación manteniendo un estancamiento persistente de la horquilla, mientras que bajas dosis de CPT podrían aumentar los eventos de iniciación en orígenes cercanos con sentido opuesto, permitiendo la fusión de las dos horquillas y la terminación de la replicación. Bibliografía Berti, M., et al., 2013. Human RECQ1 promotes restart of replication forks reversed by DNA topoisomerase I inhibition. Nat Struct Mol Biol. 20, 347-54. Boiteux, S., Jinks-Robertson, S., 2013. 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