Papel de la alteración del proceso de splicing en la aparición de enfermedades endocrino-metabólicas y patologías tumorales

Resumo

1. Introducción o motivación de la tesis La obesidad, la diabetes y el cáncer son patologías prevalentes que representan graves problemas de salud pública en todo el mundo (1-3). Una característica común compartida por estas patologías endocrino-metabólicas y tumorales es la alteración del proceso normal de splicing, lo cual podría conducir a la presencia de variantes aberrantes de ARNm (4-7). En concreto, el splicing es un proceso biológico esencial por el cual los intrones del pre-ARNm son escindidos para unir los exones y generar así ARNs maduros capaces de ser traducidos a proteínas funcionales. Sin embargo, la mayoría de genes de organismos eucariotas pueden sufrir también un proceso de splicing alternativo, el cual constituye un proceso fisiológico que permite a estos organismos aumentar exponencialmente el número de transcritos generados a partir de un mismo gen. Durante el proceso de splicing alternativo, las regiones no codificantes y codificantes de un gen se reorganizan para generar diferentes variantes de ARNm. Desafortunadamente, las desregulaciones de este proceso están asociadas a la aparición de diversas isoformas de splicing que pueden exhibir un fuerte potencial patológico (8-10). En este sentido, debe tenerse en cuenta que el control de la expresión del ARN y la correcta generación de variantes de splicing, así como su homeostasis, se lleva a cabo por el spliceosoma, una maquinaria celular compleja compuesta por ribozimas y proteínas asociadas (factores de splicing) que interaccionan de forma dinámica para catalizar el proceso de splicing (9). El funcionamiento apropiado de esta maquinaria celular es esencial para mantener la homeostasis celular, tisular y del organismo, por ello, la desregulación de este proceso ha sido asociada al desarrollo de diferentes enfermedades, incluyendo las patologías endocrino-metabólicas y tumorales (11,12). Por este motivo, la presente Tesis Doctoral parte de la hipótesis de que la alteración del proceso de splicing podría estar estrechamente relacionada con el desarrollo y progresión de enfermedades endocrino-metabólicas y tumorales. Así, el principal objetivo es explorar el potencial del proceso de desregulación del splicing (incluyendo alteraciones en componentes del spliceosoma, factores de splicing y las variantes resultantes de dicho proceso) como un nuevo campo para el estudio e identificación de marcadores diagnósticos, pronósticos y dianas terapéuticas en enfermedades tan prevalentes, como las patologías endocrino-metabólicas (obesidad y diabetes) y tumorales. Para alcanzar este objetivo general, se planteó el estudio del proceso de splicing desde diferentes enfoques experimentales y metodológicos, incluyendo muestras humanas, líneas celulares y aproximaciones moleculares in vitro e in silico. 2. Contenido de la investigación En primer lugar, para determinar la relación entre la desregulación de los componentes de la maquinaria de splicing y el desarrollo de diabetes mellitus tipo 2 (DMT2), se midieron los niveles de expresión de algunos componentes de esta maquinaria en células mononucleares de sangre periférica de pacientes en alto riesgo de desarrollar diabetes mellitus (DMT2), en condiciones tanto de ayunas como postprandiales. Esta aproximación mostró que los niveles de expresión de algunos componentes clave de esta maquinaria estaban alterados en aquellos pacientes que desarrollarían DMT2 en comparación con aquellos pacientes control que no desarrollan la enfermedad durante los 5 años de seguimiento de los pacientes. Además, la huella molecular compuesta por los niveles de expresión de estos componentes en ayunas y durante el postprandio, era capaz de predecir el desarrollo futuro de DMT2 en pacientes individuales con elevada precisión, mejorando la capacidad predictora de parámetros clásicos como la hemoglobina glicosilada o el test FINDRISK, lo cual sugería que esta huella podría representar una nueva herramienta no invasiva para la detección temprana del riesgo de desarrollar DMT2. Además, cabe destacar que, al inicio del estudio, estos pacientes fueron asignados aleatoriamente en dos grupos dietéticos saludables: 1) dieta mediterránea o, 2) dieta baja en grasa. En este sentido, los resultados presentados en esta Tesis Doctoral demuestran que la intervención dietética tras un periodo de tres años, independientemente del tipo (dieta mediterránea o baja en grasa), modula los niveles de expresión de componentes clave de la maquinaria de splicing (sobreexpresión de SPFQ, RMB45, RNU6, etc. o disminución de RNU2 o SRSF6). También observamos que algunos de estos cambios en los niveles de expresión de componentes de la maquinaria de splicing fueron inducidos diferencialmente entre aquellos pacientes que desarrollaron DMT2 y aquellos pacientes que no la desarrollaron tras cinco años de seguimiento. Por tanto, este estudio sugeriría que una intervención dietética a largo plazo podría modular los niveles de expresión de componentes clave de la maquinaria de splicing en células mononucleares de sangre periférica de pacientes en alto riesgo de desarrollar DMT2, y que dichos cambios serían claramente diferenciales en pacientes que terminan desarrollando DMT2 y aquellos pacientes que no la desarrollan tras cinco años de seguimiento, lo que podría utilizarse como en una herramienta valiosa para monitorizar la progresión de DMT2. Debido a la creciente prevalencia de la obesidad y la DMT2, la enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés) está emergiendo rápidamente como un problema de salud grave en los países occidentales. Para determinar la posible relación entre la desregulación de la maquinaria reguladora del splicing y el desarrollo de NAFLD, se midió el patrón de expresión de los componentes del spliceosoma y factores de splicing en biopsias de hígado de pacientes obesas con diferentes grados de esteatosis hepática que fueron sometidas a cirugía bariátrica. Los resultados de esta aproximación mostraron que el hígado de las pacientes obesas con esteatosis presentaba una alteración manifiesta pero diferencial (dependiente del paciente) de la maquinaria celular responsable de la regulación del proceso de splicing. El patrón de expresión de los componentes del spliceosoma y los factores de splicing analizados no se asoció con el grado de esteatosis hepática, pero identificó tres subpoblaciones de pacientes con esteatosis molecularmente definidas y caracterizadas por la expresión alterada de ciertos componentes del spliceosoma y factores de splicing. Cabe destacar, que estas subpoblaciones presentaban características clínicas específicas, así como una respuesta diferencial a la cirugía bariátrica después de un año de seguimiento. El hecho de que estas alteraciones del spliceosoma no estuvieran asociadas con el grado de esteatosis sugiere su papel como desencadenante del inicio de la acumulación de grasa en el hígado. De hecho, una aproximación in vitro mostró que las alteraciones en los componentes de la maquinaria de splicing podrían preceder al desarrollo de la esteatosis hepática. Estos resultados arrojan luz sobre los posibles mecanismos moleculares subyacentes al desarrollo de la esteatosis hepática en pacientes obesos y proporcionan información novedosa para explorar el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico, pronóstico o herramientas terapéuticas eficaces para el NAFLD. Por ultimo, para ampliar el conocimiento sobre la interacción patológica entre los procesos de splicing aberrantes y el cáncer, se realizó una caracterización del papel oncogénico del receptor truncado SST5TMD4 en patologías tumorales endocrinas. En concreto, se evaluaron las consecuencias funcionales del dominio C-terminal del receptor SST5TMD4 (expuesto extracelularmente), derivado de un proceso de splicing aberrante, en diferentes tipos celulares representativos de varias patologías tumorales. Primero, un análisis in silico reveló la existencia de dos sitios de corte para metaloproteasas de matriz (MMP) en el dominio C-terminal extracelular del receptor, que podrían ser utilizados por MMP2, 9 y 14 y/o MMP16, respectivamente, para generar tres péptidos con 7, 10 y 17 aminoácidos. El tratamiento con estos tres péptidos fueron capaces de aumentar parámetros funcionales de agresividad en diferentes líneas celulares derivadas de distintas patologías tumorales (tumores neuroendocrinos, cáncer de mama, próstata e hígado); sin embargo, algunas de estas acciones parecían ejercer diferentes dinámicas funcionales, como es el caso de la proliferación celular, o, incluso, ser dependiente de la línea celular, como ocurrió con la migración o la formación de tumorosferas. En cualquier caso, los tres péptidos aumentaron las características de malignidad de dichas líneas celulares, probablemente a través de la activación de las rutas PI3K/AKT y/o MEK/ERK y la modulación de genes pro-oncogénicos clave. En conjunto, este estudio sugiere que los péptidos derivados del receptor truncado SST5TMD4 podrían contribuir al fuerte papel oncogénico de este receptor, demostrado previamente en múltiples patologías tumorales y, por lo tanto, podrían representar posibles candidatos para identificar nuevas dianas diagnósticas, pronosticas o terapéuticas en diversos tipos de patologías tumorales. 3. Conclusión Por todo ello, los resultados presentados en esta Tesis Doctoral constituyen una información novedosa y valiosa que respalda la idea de que la desregulación del proceso de splicing (tanto las alteraciones en los componentes del spliceosoma y los factores de splicing, como en las variantes resultantes de dicho proceso) está estrechamente relacionada con la instauración y/o el desarrollo de diversas patologías como la diabetes, el hígado graso o el cáncer. 4. Bibliografía 1. Smith KB, Smith MS. Obesity Statistics. Prim Care. 2016;43(1):121-135, ix. 2. Cho NH, Shaw JE, Karuranga S, Huang Y, da Rocha Fernandes JD, Ohlrogge AW, Malanda B. IDF Diabetes Atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Res Clin Pract. 2018;138:271-281. 3. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34. 4. Stratton MR, Campbell PJ, Futreal PA. The cancer genome. Nature. 2009;458(7239):719-724. 5. Dlamini Z, Mokoena F, Hull R. Abnormalities in alternative splicing in diabetes: therapeutic targets. J Mol Endocrinol. 2017;59(2):R93-R107. 6. Webster NJG. Alternative RNA Splicing in the Pathogenesis of Liver Disease. Front Endocrinol (Lausanne). 2017;8:133. 7. El Marabti E, Younis I. The Cancer Spliceome: Reprograming of Alternative Splicing in Cancer. Front Mol Biosci. 2018;5:80. 8. Pelechano V, Wei W, Steinmetz LM. Extensive transcriptional heterogeneity revealed by isoform profiling. Nature. 2013;497(7447):127-131. 9. Matera AG, Wang Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15(2):108-121. 10. Kim HK, Pham MHC, Ko KS, Rhee BD, Han J. Alternative splicing isoforms in health and disease. Pflugers Arch. 2018;470(7):995-1016. 11. Juan-Mateu J, Villate O, Eizirik DL. Mechanisms in Endocrinology: Alternative splicing. The new frontier in diabetes research. Eur J Endocrinol. 2016;174(5):R225-R238. 12. Scotti MM, Swanson MS. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 2016;17(1):19-32.