Puesta a punto de protocolos para la transformación genética de las variedades de vid ‘tempranillo’ y ‘albariño’ e introducción de los genes vvft y vvgai relacionados con la floración temprana

Resumo

La vid (Vitis vinifera L.) es uno de los cultivos más extendidos en el mundo con gran importancia económica, la mayor parte del cultivo se dedica a la producción de uva de vinificación y en menor medida a la producción de uva de mesa, zumos y pasas. España es el segundo país europeo en producción de vid, por lo que la importancia económica del sector vitivinícola es sustancial. En nuestro país existen numerosas Denominaciones de Origen Protegidas (DOP) siendo el cultivar ‘Albariño’ de gran importancia en las DOPs de Galicia y el cultivar ‘Tempranillo’ a nivel nacional. Las metodologías de transformación genética son de gran interés puesto que ofrecen la posibilidad de modificar plantas tanto para mejorar caracteres agronómicos como para realizar estudios de genómica funcional. En la vid y especies relacionadas (Vitis sp.) esta metodología es de especial interés puesto que las variedades que se utilizan no son líneas puras, sino genotipos con alto grado de heterocigosis seleccionados a lo largo de los años por sus cualidades y que se mantienen por reproducción vegetativa. La transformación de vid se realiza principalmente mediante la inducción de callos proembriogénicos y su subsiguiente infección utilizando cepas de Agrobacterium tumefaciens (actualmente Rhizobium radiobacter) portadoras del gen o genes de interés, pero también mediante biolística, aunque este método suele ser mejor para estudios de expresión transitoria. La regeneración de plantas de vid a partir de las células transformadas es dificultosa, lo que implica un problema a solucionar al utilizar esta metodología. El objetivo de esta tesis es la puesta a punto de protocolos para la transformación de las variedades de vid ‘Tempranillo’ y ‘Albariño’, y la introducción de los genes VvFT y Vvgai. Estos genes están implicados en la inducción floral y podrían conferir a las plantas una floración temprana y un acortamiento del periodo juvenil, lo que sería de gran interés en la vid debido a que su fase juvenil puede durar varios años. Además, facilitaría la realización de estudios genéticos y programas de mejora. Se ha comprobado que la expresión del gen Vvgai da lugar a plantas enanas sin modificar el tamaño de la baya y la generación de semillas lo que facilita su manejo. Para alcanzar el objetivo de este trabajo se han llevado a cabo ensayos para establecer líneas embriogénicas que constituyen el material a transformar; se han elaborado dos construcciones portadoras de los genes VvFT y Vvgai utilizando plásmidos pGreen y se han estudiado distintos factores que afectan a la transformación mediante biolística (influencia de diferentes tipos y tamaños de partícula, velocidades de agitación de las partículas durante la adherencia del ADN (coating) y evaluación del tipo y concentración de los agentes selectivos). Por otra parte, se ha evaluado los antibióticos y las concentraciones más adecuadas para llevar a cabo la selección de las plantas transgénicas. Este paso es limitante en los protocolos de transformación y por lo tanto, llevar a cabo una selección adecuada es muy importante tanto en si se utiliza la metodología biolística como la mediada por A. tumefaciens. Como resultado de los ensayos realizados se ha obtenido expresión transitoria en ensayos de biolística con las variedades ‘Albariño’ y ‘Tempranillo’y también se han regenerado plantas de estas variedades que han insertado los genes VvFT y Vvgai. La integración de los genes en las plantas regeneradas ha sido confirmada mediante PCR o por secuenciación. En cuanto al fenotipo en el marco de esta tesis se ha podido observar floración temprana en cultivo in vitro en algunas de las plantas que habían integrado el gen VvFT y un mayor número de entrenudos cortos en plantas trangénicas (portadoras del gen Vvgai) cultivadas en invernadero.