Modulación de la producción y caracterización estructural de los exopolisacáridos en cianobacterias diazotróficas, y estudio de su utilización para el tratamiento del digestato líquido de la digestión anaeróbica de efluentes de una procesadora de pescado

Resumo

Las cianobacterias es un grupo de microorganismos fotosintéticos que aparecieron en la Tierra hace más de 2400 millones de años. Son organismos procariotas ubicados por sus características en el grupo de las bacterias Gram-negativas. Las cianobacterias presentan complejas rutas metabólicas para las síntesis de los carbohidratos, que les permiten sintetizar carbohidratos intracelulares, reservas de polímeros como el glucano y polisacáridos extracelulares estructuralmente complejos. Los polisacáridos extracelulares se presentan asociados con la superficie celular en forma de envolturas, cápsulas y material viscoso, y polisacáridos liberados al medioambiente circundante, los exopolisacáridos disueltos. Los exopolisacáridos disueltos son porciones solubles de material polisacárido liberados al medio, a partir de las capas externas o derivados de complejos procesos biosintéticos. La importancia de estos polímeros radica en la facilidad de su recuperación del medio de cultivo y debido a que en su compleja estructura incluye grupos sulfato, fosfato, acetato, ácidos urónicos, fracciones proteicas, así como una compleja estructura y composición monosacárida, lo que les confiere propiedades fisicoquímicas interesantes para diversos campos como: biomedicina, farmacéutica, alimenticia, remediación de efluentes residuales, etc. El uso de las cianobacterias en el tratamiento de aguas residuales ha sido ampliamente documentada en la purificación de purines porcinos con interesantes resultados. Sin embargo es indispensable evaluar el potencial de estos microorganismos en la depuración de otro tipo de efluentes industriales. La presente investigación tuvo como objetivos principales: a) Estudiar la posibilidad de modular la producción, composición y estructura de los exopolisacáridos disueltos producidos por cianobacterias filamentosas fijadoras de nitrógeno mediante la manipulación de las condiciones de cultivo, modificando algunos parámetros nutricionales y físicos. Para ello se realizó la caracterización bioquímica y estructural de los exopolisacáridos disueltos de Nostoc sp. PCC 7413 y PCC 7936, y se evaluó su bioactividad. Evaluar la viabilidad de la utilización de las cianobacterias para el tratamiento del digestato líquido producto de la digestión anaeróbica de efluentes residuales de una procesadora de pescado. Para la modulación de la producción, composición y estructura de los exopolisacáridos disueltos de PCC 7413 y PCC 7926 se evaluaron las condiciones de disponibilidad de nitrógeno combinado, regímenes de iluminación (ciclos luz:oscuridad y luz continua), así como la adición de iones fosfato, sulfato y acetato al medio de cultivo, con el objetivo de que se incorporen a la estructura del polisacárido. Esta esperada modificación estructural viene planteada porque es la compleja estructura de estos polímeros la que le confiere sus posibles aplicaciones biotecnológicas. Los resultados obtenidos indican la factibilidad de incrementar la producción de estos polímeros en algunas de las condiciones evaluadas. La producción de exopolisacáridos disueltos se incrementa significativamente cuando se cultiva con iluminación continua en ambas cepas. En ambas cianobacterias la producción de exopolisacáridos disueltos (peso seco) es significativamente mayor en condiciones no diazotróficas con respecto a la condición diazotróficas en ambos regímenes de iluminación. La adición de iones sulfato al medio de cultivo no incrementan la producción de exopolisacáridos disueltos (peso seco) en ninguna de las especies evaluadas, mientras que la adición de iones fosfato disminuyó la concentración de estos polímeros en todas las condiciones de disponibilidad de nitrógeno combinado y regímenes de iluminación evaluados. Los iones acetato incrementan la producción de exopolisacáridos disueltos sólo en PCC 7413. Este efecto es mayor en condiciones diazotróficas en donde el acetato es utilizado como fuente de carbono, lo que no ocurre en condiciones no diazotróficas. Para realizar la caracterización bioquímica y estructural de los exopolisacáridos disueltos se determinaron la composición elemental, porcentaje de grupos sulfato, porcentaje proteico, densidad aniónica, composición monosacárida, ratio molar de los residuos monosacáridos y peso molecular. Además, se realizó el análisis de espectroscopia Infrarroja por Transformadas de Fourier-Reflectancia Total Atenuada (ATR-FTIR). Los resultados obtenidos en la caracterización bioquímica y estructural de los exopolisacáridos disueltos de ambas cepas, demostraron la modificación en su composición y estructura dependiendo de las condiciones de cultivo. Se incrementó significativamente la fracción proteica de los exopolisacáridos disueltos de PCC 7413 y de PCC 7936 mediante la adición de iones sulfato y acetato. Esta modificación específica de la estructura de los polisacáridos disueltos de Nostoc sp. PCC 7413 y PCC 7936 nos proporciona interesantes aplicaciones biotecnológicas. Al igual de lo ocurrido con la fracción proteica, es factible modificar la proporción de los grupos sulfato en los exopolisacáridos solubles de PCC 7413 y PCC 7936 mediante la adición de iones sulfato en el medio. A pesar de que el incremento de los grupos sulfato fue significativo, los exopolisacáridos disueltos de ambas cepas son polisacáridos con un grado de sulfatación bajo. Los exopolisacáridos disueltos de PCC 7413 y PCC 7936 presentan grupos sulfato y ácidos urónicos, grupos funcionales que le dan la característica de polianiónicos, sin embargo mediante la técnica del Alcian Blue no fue posible determinar esta característica con precisión, por lo que dicha técnica no es adecuada para realizar dicha caracterización. Con el análisis ATR-FTIR de los exopolisacáridos disueltos se confirmó la presencia de la fracción proteica, los ácidos urónicos, los grupos sulfato y su porcentaje en la estructura polisacárida de ambas cianobacterias. No se produjeron cambios en los residuos monosacáridos mediante la manipulación de las condiciones de cultivo, pero se presentaron cambios significativos en el ratio molar de los mismos. Se logró incrementar significativamente la concentración molar de los ácidos urónicos en ambas cepas, con el tratamiento con iones acetato en condiciones diazotróficas con luz continua para PCC 7413, y en ambas condiciones de disponibilidad de nitrógeno combinado con luz continua para PCC 7936. Para evaluar la bioactividad de los exopolisacáridos disueltos de ambas cianobacterias y en base a la caracterización bioquímica y estructural, se seleccionaron los polímeros que combinaban un alto porcentaje de grupos sulfato y una alta molaridad de los ácidos urónicos en su estructura, ya que estas dos características estructurales le confieren al polímero su mayor o menor carga polianiónica, propiedad que les confiere a los exopolisacáridos de microalgas sus características antivirales, antioxidantes, antiinflamatorias, citotóxicas, e inmunomoduladores. Los resultados obtenidos evidenciaron el interés de una futura evaluación de su uso en biomedicina como factores que incrementen la proliferación celular o como promotores de la cicatrización de heridas. Además se destaca el potencial de los exopolisacáridos disueltos de PCC 7413 para ser estudiados en el área de los biomateriales anticancerígenos. Se cultivaron tres cepas: Nostoc sp. PCC 7413; Nostoc sp. PCC 7936; y Arthrospira (Spirulina) sp. para analizar el potencial de las cianobacterias en la depuración del digestato líquido producto de la digestión anaeróbica (DLDA) de efluentes de una procesadora de pescado con elevadas concentraciones de amonio en su composición. Se evaluó el crecimiento, la producción de exopolisacáridos y proteínas en este tipo de residuo, y el consumo de amonio como fuente de nitrógeno combinado. De entre las especies evaluadas, Arthrospira (Spirulina) sp. se presentó como de especial interés, por su elevada tolerancia a altas concentraciones de amonio, y por su gran producción de proteínas. Igualmente se destacó PCC 7413 por su elevada eficiencia de remoción y su gran producción de exopolisacáridos disueltos en este tipo de agua residual. Se pudo obtener crecimiento en cultivos con DLDA de efluentes de una procesadora de pescado, soportando concentraciones de amonio de 4,90; 5,50; y 11,90 mM para PCC 7413, PCC 7936 y Arthrospira (Spirulina) sp.; respectivamente. En el sistema de cultivo semi-continuo con DLDA se presentó un nutriente limitante, probablemente el fósforo que impide el mantenimiento prolongado de los cultivos solo con DLDA, por lo que para su utilización debería ser corregida esta concentración. Es necesario llevar a cabo estudios adicionales que permitan confirmar el papel limitante del P en estos efluentes. En cultivo semi-continuo PCC 7413 presentó una eficiencia de remoción (ER) de 89,99 ± 7,06% día-1, PCC 7936: 44,7 ± 11,3% día-1, y Arthrospira (Spirulina) sp. de 54,04 ± 9,23% día- 1, con una remoción de amonio de: 4,01 ± 0,91 mM día-1, 2,55 ± 0,68 mM día-1, y 5,29 ± 1,08 mM día-1 para PCC 7413, PCC 7936 y Arthrospira (Spirulina) sp., respectivamente. Comprobamos que si bien Arthrospira (Spirulina) sp. no presentó la ER diaria más alta, su capacidad de remoción de amonio es significativamente mayor (1,3 veces la ER de PCC 7413, y dos veces la ER de PCC 7936), que las otras dos cianobacterias evaluadas. Con los resultados obtenidos en esta investigación se confirma el gran potencial biotecnológico de las cianobacterias en la producción de exopolisacáridos con interesantes propiedades estructurales, y la gran capacidad de estos microorganismos en la depuración de efluentes industriales con una elevada concentración de amonio.