Estudio del perfil analítico de toxinas marinas y de agua dulce

Resumo

En la presente tesis doctoral se aborda el desarrollo y la optimización de métodos de métodos detección para la identificación y cuantificación de toxinas marinas y de toxinas de agua dulce. Inicialmente, se desarrolló un método de LC-MS/MS para la detección y cuantificación de cianotoxinas, identificando así 6 análogos de ATX-a, 7 MCs, NOD y CYN. Este método de 12.5 min permitió la diferenciación de la ATX-a y la Phe. Se analizaron 150 muestras procedentes de diferentes localizaciones europeas y los resultados obtenidos mostraron que la mayoría de las muestras de agua recogidas contenían dos análogos de la ATX-a, H2-homoATX- a y H2-ATX-a. Posteriormente, se desarrolló un método para la detección CTXs mediante LC-MS. Se analizaron 94 muestras de diferentes procedencias para la búsqueda de nuevos vectores y se detectaron tres análogos de CTXs, m/z 1111.5, m/z 1109.5 y m/z 1123.5, en siete de las muestras. Al mismo tiempo, se abordó el problema de la obtención de estándares analíticos de CTXs a partir de Gambierdiscus como organismo productor. La cepa ccmp401 de este dinoflagelado fue cultivada en condiciones controladas y sus extractos se analizaron mediante LC-MS detectándose la presencia de 4 compuestos similares a las CTXs, aunque ninguno conocido. Se aisló 1.2 mg de una de las moléculas y se identificó su estructura a partir de datos de resonancia magnética nuclear. La estructura propuesta para este compuesto es un nuevo polieter cíclico con cadenas laterales que se denominó gambierona. Se estudió su actividad biológica y se observó que actuaba sobre los canales de sodio e inducía la entrada de una pequeña cantidad de calcio de la misma forma que el estándar de CTX3C, aunque menos potente. El método oficial para la detección de toxinas lipofílicas es un método analítico de LC-MS/MS que se optimizó para la detección de este grupo de toxinas reguladas y para los espirólidos. Empleando este método se analizaron 150 muestras recogidas en España, Marruecos y Portugal. Así, se detectó OA en nueve nuevos vectores procedentes de Marruecos. Un punto a tener en cuenta en el método oficial para la detección de las toxinas lipofílicas es el efecto del procesado de la muestra, a nivel industrial y doméstico, sobre las DSPs y sus derivados. Estos resultados demostraron que durante la cocción parte de la dinofisistoxina-3 presente en la muestra se transforma en OA, pero el proceso de cocción no afecta a la toxicidad total de la muestra. A continuación, se estudió la relación entre la TTX y los dinoflagelados Prorocentrum minimum debido a que en el año 2012 cuando se detectó TTX en las costas griegas y a su vez había una floración de estos dinoflagelados, pero no se sabía que toxinas producían. Para establecer dicha conexión se estudió el crecimiento y la toxicidad de P. minimum en diferentes condiciones. Se cultivaron tres cepas (ccmp1519, ccmp2811 y ccmp2956), se extrajeron y se analizó la actividad de esos extractos sobre al canal de sodio utilizando el estándar de TTX como control positivo. Las cepas ccmp1519 y ccmp2956 que crecieron a 24°C y 37‰ de salinidad presentaban efecto inhibitorio sobre los canales de sodio. Para determinar la estructura de esos compuestos con actividad similar a la TTX lo primero que se hizo fue obtener el patrón de fragmentación de la TTX. Los extractos se analizaron buscando ese patrón y se encontraron dos compuestos de m/z 265 y m/z 308 que cumplían dicho patrón. Además, se observó la presencia de bacterias del género Roseobacter y Vibrio, ambas asociadas a la producción de TTX. Debido a la necesidad de métodos más rápidos y sensibles que permitan agilizar la monitorización, se desarrollaron dos nuevos métodos que permiten detectar y cuantificar un gran número de toxinas marinas en una única inyección. El primer método permite la detección de toxinas marinas hidrofílicas (PSTs, TTX y DA) en un tiempo de 15 min. Este método presenta unos límites de cuantificación inferiores a los límites legales permitidos para estos grupos de toxinas. En el segundo método se detectan toxinas lipofílicas además de la hidrofílicas anteriores e igual que en el método anterior los límites de cuantificación para estas toxinas son inferiores a los límites legales permitidos. Se determinó la reproducibilidad y el efecto matriz para cada toxina en ambos métodos y se concluyó que ambos métodos con límites de cuantificación bajos y reproducibles permiten la identificación y cuantificación de las toxinas marinas hidrofílicas y lipofílicas. Por lo tanto, esta tesis doctoral aporta nuevos métodos de detección para toxinas marinas y de agua dulce y la optimización de métodos ya existentes que mejoran su detección y cuantificación.