Mejora e innovación en los procedimientos de detección y cuantificación de los métodos de análisis de toxinas PSP

Zusammenfassung

En los últimos años, las floraciones de algas nocivas (FAN) han atraído cada vez más la atención tanto de la comunidad científica como de la sociedad. A pesar de que estos fenómenos naturales han tenido lugar a lo largo de toda la historia, se está observado en la actualidad un claro incremento en regiones costeras de todo el mundo. Por ello se han implementado medidas más eficaces y complejas para prevenir la intoxicaciones humanas por consumo de moluscos. El número de toxinas a ensayar ha sido actualizado a lo largo de los años al igual que los métodos a usar. Pero esto no es así con los animales que actúan como vectores de estas toxinas. La presente Tesis se centra en el grupo de toxinas paralizantes (PSP), para el cual existe un claro incremento de nuevos vectores. Por esta razón, uno de los objetivos de este trabajo fue evaluar la eficacia del método de cromatografía líquida de alta eficacia con detección por fluorescencia (HPLC-FLD) y oxidación post-columna (PCOX) cuando se aplica a diferentes especies de moluscos, gasterópodos y crustáceos. Los resultados mostraron la necesidad de ajustar el método para las matrices estudiadas. Además se realizó una comparación entre los dos métodos HPLC-FLD validados por la AOAC (pre-columna y post-columna) en muestras reales. Se concluyó que el método PCOX es una herramienta fiable para la identificación y cuantificación de las PSP. Las carencias de estos métodos junto con la reciente aparición de la tetrodotoxina (TTX) y sus análogos en las costas europeas ponen de manifiesto la necesidad de desarrollar nuevos métodos químicos capaces de diferenciar entre ambos grupos de toxinas. Por esta razón, otro de los objetivos de esta Tesis Doctoral fue proponer nuevos métodos de análisis. Se presenta un nuevo método HPLC-FLD con oxidación post-columna basado en el uso de una columna de carbono grafitizado poroso que demostró ser rápido, sensible y que posee la capacidad de distinguir las PSP de la TTX en un sólo análisis. Además se propone un nuevo proceso de limpieza de muestras que dio muy buenos resultados. Se aprovecharon las excelentes características que muestra la columna de carbono grafitizado poroso para la separación de las PSP y la limpieza obtenida en el método previo, para el desarrollo de un nuevo método de cromatografía líquida con detección por espectrometría de masas (LC-MS/MS). Este método demostró ser capaz de separar un amplio número de toxinas PSP (hidrófilas e hidrófobas) junto con la TTX y su análogo 4,9-anhTTX, siendo el primer método químico capaz de realizar este análisis simultáneo.