Interacciones entre el Escuticociliado parásito "Philasterides dicentrarchi" (Ciliophora: Scuticociliatia) y el sistema inmunitario del rodaballo, "Psetta maxima" (L.)

  1. Piazzon de Haro, María Carla
Dirixida por:
  1. José Manuel Leiro Vidal Director
  2. Jesús Lamas Fernández Director

Universidade de defensa: Universidade de Santiago de Compostela

Fecha de defensa: 15 de decembro de 2010

Tribunal:
  1. Manuel L. Sanmartín Durán Presidente/a
  2. Manuel Noia Guldris Secretario
  3. Maria Forlenza Vogal
  4. José Manuel García Estévez Vogal
  5. Victoriano Francisco Mulero Méndez Vogal
Departamento:
  1. Departamento de Microbioloxía e Parasitoloxía

Tipo: Tese

Resumo

1. INTRODUCCIÓN La escuticociliatosis, una enfermedad causada por parásitos ciliados histiófagos, es un problema emergente en peces planos cultivados. Entre ellos, el escuticociliado Philasterides dicentrarchi (sin. Miamiensis avidus) ha causado considerables mortalidades en el rodaballo cultivado en Galicia y en otras partes de España, en Francia y en Portugal, siendo considerado en este momento uno de los patógenos que más pérdidas económicas causa en esta especie, debido a su elevada capacidad invasiva y a que no existen medidas eficaces para prevenir o tratar la enfermedad (Dyková y Figueras, 1994; Sterud et al., 2000; Iglesias et al., 2001; Álvarez-Pellitero et al., 2004 a; Ramos et al., 2007). Los peces infectados muestran úlceras cutáneas, oscurecimiento de la piel, alteraciones en la natación, exoftalmia y distensión abdominal como resultado de la acumulación de líquido ascítico en la cavidad corporal. Los ciliados aparecen en todos los órganos y tejidos de los rodaballos infectados, incluyendo la sangre y el fluido ascítico (Dyková y Figueras, 1994; Sterud et al., 2000; Azad et al., 2007; Jung et al., 2007; Ramos et al., 2007). Aunque P. dicentrarchi puede ser destruido fácilmente por tratamientos con formalina cuando se encuentra en el medio externo, no existe hasta la fecha ningún tratamiento terapéutico eficaz cuando el parásito se localiza en el interior del pez produciendo la enfermedad sistémica. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha desarrollado de forma preliminar una vacuna con una elevada eficacia frente al aislado utilizado para realizarla (Lamas et al., 2008; Sanmartín et al., 2008). Cuando esta vacuna fue probada en experimentos de campo, los resultados obtenidos fueron variables. La existencia de diferentes serotipos o cepas de escuticociliados ha sido previamente propuesta por otros autores debido a las diferencias en virulencia encontradas (Puig et al., 2007; Álvarez-Pellitero et al., 2004 a). Es posible, por lo tanto, que la poca protección obtenida en algunos experimentos de vacunación se deba a la existencia de diferencias antigénicas entre aislados de distintas piscifactorías. Existe poca información sobre los mecanismos de interacción del parásito con el sistema inmunitario del hospedador, incluyendo los aspectos inmunopatogénicos de la infección y la búsqueda de moléculas inmunogénicas candidatas a la producción de vacunas eficaces para la prevención de esta enfermedad. 2. OBJETIVOS Con lo anteriormente establecido, nos planteamos los siguientes objetivos concretos: 1. Determinar la existencia de serotipos entre aislados de P. dicentrarchi, analizando las diferencias en su antigenicidad y protección cruzada con el objetivo de producir una vacuna con eficacia global. 2. Determinar cómo estos parásitos o sus componentes antigénicos (componentes de membrana, proteasas, etc.) afectan a la respuesta inmunitaria del rodaballo, usando tanto modelos in vitro como in vivo. 3. Establecer la importancia de las respuestas humorales (anticuerpos específicos, complemento, etc.) y celulares del rodaballo en su capacidad para destruir estos parásitos, tanto in vitro como in vivo. Todos los experimentos fueron llevados a cabo con dos aislados de P. dicentrarchi (C1 e I1) obtenidos de dos brotes de escuticociliatosis surgidos en dos granjas de rodaballo situadas en dos zonas geográficas distintas del noroeste de España para definir las diferencias o similitudes entre ellos respecto a los parámetros estudiados. 3. METODOLOGÍA La metodología utilizada para la realización de esta tesis abarca un amplio número de técnicas que se resumen a continuación. Para desarrollar el primer objetivo, se han llevado a cabo protocolos de vacunación y de purificación de diferentes antígenos a partir de cultivos axénicos de P. dicentrarchi. La obtención de anticuerpos policlonales, tanto de peces como de ratones inmunizados, permitió caracterizar mediante ELISA o western-blot la presencia de diferentes patrones antigénicos en los diferentes aislados del ciliado. Utilizando espectrometría de masas y bases de datos de proteínas, se realizó la caracterización de proteínas con potencial interés para la producción de vacunas. Gracias a análisis genéticos se han obtenido secuencias parciales de proteínas del parásito para proceder a su análisis filogenético y comparación entre aislados. Para estudiar la interacción de estos parásitos con el sistema inmunitario del rodaballo, se han realizado ensayos in vitro tanto con suero como con células del pez. Las actividades humorales se evaluaron mediante ensayos de actividad hemolítica (usando eritrocitos de carnero) o parasiticida de los sueros, para estudiar la actividad complemento por las vías alternativa y clásica respectivamente. También se evaluó la actividad lisozima mediante ensayos en placa. Las proteasas de P. dicentrarchi se purificaron mediante cromatografía de afinidad con bacitracina y su actividad proteolítica se verificó mediante SDS-PAGE-sustrato (actividad gelatinolítica) o utilizando FITC-BSA. Para estos ensayos también se requirió la purificación de proteasas y anticuerpos de sueros de rodaballo, ambas obtenidas por técnicas cromatográficas de afinidad (bacitracina y proteína A respectivamente). Diferentes combinaciones de los ensayos anteriormente descritos y las moléculas purificadas permitieron la evaluación de la interacción del ciliado y sus componentes con los factores humorales del rodaballo. Las actividades celulares se realizaron mediante ensayos en placa tras la purificación de diferentes poblaciones de leucocitos de rodaballo (riñón, peritoneales, sanguíneos). Las actividades evaluadas fueron estallido respiratorio (ensayo del NBT), degranulación (utilizando OPD), producción de NO (reacción de Griess) o actividad arginasa. También se evaluó la expresión de genes relacionados con la respuesta inmunológica (TNF-a, Il-1b, mieloperoxidasa, arginasa, C3, C1q, etc.) en leucocitos de rodaballo estimulados con fracciones del parásito, mediante RT-PCR semicuantitativa. La respuesta del ciliado frente a las actividades celulares del rodaballo se evaluó utilizando ensayos de microscopía óptica, para estudiar la capacidad fagocítica, y ensayos in vitro para evaluar su susceptibilidad a diferentes agentes oxidantes, complemento, anticuerpos o productos celulares. También se usaron técnicas enzimáticas para evaluar su capacidad detoxificante, estudiando las actividades superóxido dismutasa y catalasa. Para los estudios in vivo se diseñaron protocolos de vacunación y extracción de muestras. Se determinó el tiempo de eliminación del parásito en peces inmunizados mediante observación microscópica. También se evaluaron parámetros humorales (actividad complemento y lisozima) y celulares (quimiotaxis, estallido respiratorio, expresión de genes, nitración de tejidos). Finalmente, se estudió la producción de óxido nítrico por parte de leucocitos del rodaballo mediante inmunohistoquímica (para evaluar nitración de tejidos) o pruebas bioquímicas (reacción de Griess para evaluar producción de nitritos). Para ello, se realizaron diferentes protocolos de estimulación con sustancias estimuladoras (ulvano, PMA, LPS), medios condicionados (MAF) o sueros de peces infectados. También se generaron sistemas artificiales con dadores de óxido nítrico, leucocitos estimulados y sustancias potencialmente reactivas con el óxido nítrico (hemoglobina, ácido hipocloroso, anión superóxido) para evaluar el posible consumo del NO y la consecuente dificultad de la medida mediante la reacción de Griess. Dentro de este capítulo, también se ha amplificado, clonado y secuenciado una secuencia parcial de un gen que codifica para una óxido nítrico sintetasa en leucocitos de riñón anterior del rodaballo. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Las vacunaciones realizadas fueron efectivas en cuanto a producción de anticuerpos y protección. Sin embargo, los estudios de protección cruzada y reactividad antigénica entre estos dos aislados mostraron que las vacunas producidas con una cepa inducían una elevada protección frente a la misma, mientras que la protección bajaba cuando se infectaba con la otra cepa. Los patrones antigénicos obtenidos mediante western-blot, así como las reactividades obtenidas en los ensayos de ELISA y las pruebas de aglutinación mostraron que, efectivamente, existían importantes diferencias antigénicas entre estos dos aislados. Estos resultados nos permitieron establecer la existencia de, al menos, dos serotipos de P. dicentrarchi diferentes, aspecto muy relevante a la hora de desarrollar una futura vacuna frente a este parásito. Al analizar la reactividad de varias fracciones del ciliado (membrana, cilios, fracción total enriquecida en citoplasma, etc.) observamos que las diferencias entre serotipos residen principalmente en la composición de las membranas externas, posiblemente en los llamados antígenos de inmovilización (i-antígenos), haciendo de estos antígenos presentes en la fracción membranosa del ciliado, los candidatos más adecuados para separar serotipos y estudiar diferencias en los patrones antigénicos entre aislados. Analizando proteínas comunes de las membranas de estos ciliados, que mostraron reactividad cruzada entre los dos serotipos y con el objetivo de caracterizar una molécula potencialmente candidata para el desarrollo de una vacuna global, seleccionamos la enzima pirofosfatasa inorgánica que resultó estar altamente conservada entre los serotipos estudiados y, además, posee la peculiaridad de que se trata de una proteína no presente en animales vertebrados. P. dicentrarchi mostró una alta sensibilidad a la actividad complemento del suero, especialmente cuando los peces fueron vacunados con el serotipo homólogo, resaltando la importancia de la vía clásica del complemento en la destrucción de este parásito, ya que la presencia de anticuerpos específicos incrementaba la sensibilidad del parásito a la lisis mediante el complemento. Dentro de este parámetro, observamos una mayor susceptibilidad del serotipo C1 frente a factores humorales respecto al serotipo I1. Durante la infección, estos parásitos secretan cisteín proteasas que fueron capaces de destruir factores del complemento así como anticuerpos. Estas enzimas podrían facilitar la defensa del parásito frente al ataque del sistema inmunitario del pez, favoreciendo la invasión del hospedador. Respecto a las proteasas secretadas por estos ciliados, no aparecieron diferencias evidentes entre los serotipos estudiados resaltando otra vez el hecho de que las diferencias serotípicas aparecen fundamentalmente en las fracciones externas del ciliado. Respecto a los parámetros celulares de la respuesta inmunitaria innata, estudiamos in vitro la capacidad estimuladora de las diferentes fracciones del ciliado sobre leucocitos de rodaballo. En estos ensayos encontramos que, coincidiendo con la mayor virulencia de I1 respecto a C1, el aislado I1 mostró mayor capacidad estimuladora del estallido respiratorio y de la expresión de citocinas en leucocitos del riñón anterior. Las fracciones que más estimularon fueron las fracciones externas, membrana o ciliar, que fueron las responsables de las diferencias en activación entre los diferentes aislados. Además, a pesar de que C1 mostró mayor actividad de enzimas detoxificantes (superóxido dismutasa y catalasa), ambos ciliados presentaron la misma resistencia a las especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno o a la incubación con leucocitos activados, productores de especies reactivas del oxígeno y nitrógeno. Estos estudios in vitro demostraron que estos ciliados eran susceptibles a la incubación con complemento y anticuerpos y que el serotipo I1 era más resistente que el C1. De modo que, las diferencias en virulencia pueden ser explicadas, al menos parcialmente, como diferencias en susceptibilidad a la actividad del complemento. Estos resultados sugieren que los factores humorales, como el complemento activado mediante la vía clásica, son críticos para la defensa del pez frente a P. dicentrarchi y que las respuestas celulares juegan un papel menor en la defensa frente a este parásito. Los ensayos in vivo fueron realizados sobre peces vacunados con ambos aislados y se estudiaron diferentes parámetros, tanto celulares como humorales de la respuesta inmunitaria, durante la infección con I1 o C1. La vacunación con los dos aislados, a una dosis de 106 ciliados/ml de cada serotipo, indujo la producción de anticuerpos específicos y generó una protección frente a la infección con ambos aislados observándose la eliminación de los ciliados de la cavidad peritoneal a las 48 o 72 horas post-infección, en el caso de los aislados C1 e I1 respectivamente. De forma general, cuando los peces inmunizados fueron infectados con P. dicentrarchi, se produjo una respuesta inflamatoria que indujo la activación de leucocitos y su migración hacia la cavidad peritoneal y también se detectó una mayor producción de citocinas proinflamatorias como el TNF-a. La activación de macrófagos y neutrófilos en el lugar de la inflamación produjo un incremento en la producción de radicales oxidativos que dio lugar a la nitración de los tejidos locales. Los factores humorales también fueron afectados, de forma que encontramos un incremento de la actividad lisozima y de la vía alternativa del complemento observando, a su vez, un incremento de la expresión de los factores C3 y C1q del complemento. Sin embargo, la actividad lítica de los diferentes sueros no mostró diferencias entre peces infectados y no infectados, siempre y cuando estuvieran inmunizados. En general, las respuestas fueron mayores cuando se infectaron los peces con el aislado I1. El aislado I1 demostró ser más difícil de eliminar persistiendo más tiempo que el C1 en la cavidad peritoneal. De esta forma, las respuestas más altas encontradas en los peces infectados con I1 pueden estar relacionadas con el hecho de que permaneció más tiempo en dicha cavidad. Cuando los peces no están inmunizados, la infección se desarrolla rápidamente superando la capacidad del sistema inmunitario produciendo una rápida invasión sistémica que conlleva la muerte del rodaballo en un corto periodo de tiempo. Tanto el ciliado entero como las fracciones de P. dicentrarchi estimularon el estallido respiratorio en leucocitos de rodaballo in vitro e in vivo. A pesar de ello, no pudimos detectar producción de NO en forma de nitritos en ninguna de estas condiciones, hecho que nos hizo pensar que la producción de especies reactivas en leucocitos de rodaballo es más dependiente del oxígeno que del nitrógeno. Sin embargo, observamos nitración en los ensayos inmunohistoquímicos y en los ensayos ELISA realizados en tejidos de rodaballos infectados, de forma que es evidente que algo de estrés nitrosativo está teniendo lugar, ya que para la formación de nitrotirosina, a parte del superóxido, es necesaria la presencia de peroxinitrito. Todo esto nos llevó a estudiar con más detalle la producción de especies reactivas del nitrógeno por parte de los leucocitos del rodaballo, buscando el estímulo adecuado para la producción de NO, así como estudiando el posible efecto que algunas moléculas reactivas como la hemoglobina, el superóxido o el ácido hipocloroso puedan tener sobre la persistencia del NO en forma de nitrito, interfiriendo en su medida directa. También intentamos clonar y caracterizar el gen de la óxido nítrico sintetasa que se expresa en leucocitos de rodaballo. Se demostró que para producir NO, los leucocitos de rodaballo necesitaban encontrarse en un estado activado inducido por factores humorales presentes en sueros de peces infectados, como por ejemplo, el TNF-a u otras citocinas o quimiocinas, y estar, además, estimulados con sustancias como el ulvano. De todas formas, el NO parece producirse en cantidades muy bajas y es posible que también pueda reaccionar rápidamente con otras moléculas reactivas presentes en los cultivos celulares de riñón anterior o células peritoneales, dificultando su medida directa. Desde un punto de vista genético, clonamos y caracterizamos una secuencia parcial del gen que codifica una óxido nítrico sintasa (NOS) en leucocitos de riñón que, a pesar de tener una homología nucleotídica mayor con NOS neuronales que con NOS inducibles de otros peces, demostró poseer una expresión regulada por sustancias estimuladoras como el ulvano o fracciones de membrana del parásito P. dicentrarchi. 5. CONCLUSIONES De los resultados obtenidos en esta tesis, hemos extraído las siguientes conclusiones: 1. Hemos confirmado la existencia de diferentes serotipos de Philasterides dicentrarchi, basándonos en diferencias en su antigenicidad, protección cruzada y virulencia en el rodaballo. Así, los dos aislados usados son diferentes en composición antigénica de las fracciones externas y en virulencia. La inmunización estimula principalmente la protección frente al aislado homólogo. 2. El complemento del rodaballo juega un papel muy importante en la defensa del hospedador frente a P. dicentrarchi. Ambos aislados son destruidos por el complemento del pez, especialmente cuando se activa la vía clásica. Los anticuerpos por sí solos no tienen capacidad lítica. Los aislados de P. dicentrarchi son diferentes en la susceptibilidad frente al complemento, siendo I1 más resistente que C1, de forma que se puede establecer una correlación entre la virulencia del aislado y su susceptibilidad a la lisis por el complemento. 3. Durante la infección, P. dicentrarchi secreta proteasas capaces de destruir inmunoglobulinas y componentes del complemento. Estas proteasas ayudan al parásito a evadirse de la respuesta inmunológica del hospedador. 4. Los componentes de P. dicentrarchi, especialmente las fracciones ciliar y membranosa, estimulan los leucocitos de rodaballo, incrementando el estallido respiratorio, la degranulación y la expresión de citocinas proinflamatorias en estas células. De todas formas, los leucocitos por sí solos no son capaces de destruir al ciliado indicando que la respuesta celular juega un papel muy pequeño, si es que juega alguno, en la defensa frente a este parásito. A pesar de que los ciliados son susceptibles al peróxido de hidrógeno, superóxido y peroxinitritos, las cantidades de estas moléculas oxidantes producidas por los leucocitos no llegan a ser lo suficientemente altas como para matar al ciliado. 5. En infecciones experimentales, los ciliados proliferan en los peces control pero son destruidos rápidamente en peces inmunizados. El aislado I1 induce una mayor activación de leucocitos pero es más persistente que C1 en el lugar de la infección, confirmando los resultados obtenidos en los estudios in vitro.