X chromosome markers, genetic characterizations, population analysis and forensic applications

Resumo

Introducción En los últimos años, el estudio de la variabilidad genética humana ha contribuido a elucidar cuestiones relacionadas con la historia de las poblaciones humanas así como ha permitido el progreso de la Genética forense. La mayoría de estos estudios se han centrado, hasta hace poco tiempo, en la investigación de polimorfismos localizados tanto en los autosomas como en el cromosoma Y así como en el ADN mitocondrial (mtADN). Sin embargo, el estudio de marcadores localizados en el cromosoma X ha demostrado ser cada vez más importante, tanto en el campo de la genética poblacional como forense (Szibor et al. 2003c; Schaffner, 2004; Szibor, 2007). El cromosoma X tiene muchas características que no son compartidas con el cromosoma Y ni con ninguno de los autosomas del genoma humano. Sus características estructurales únicas provienen del proceso evolutivo que ha originado los cromosomas sexuales, responsables de las diferencias actuales entre los dos sexos. En los hombres la presencia de una sola copia del cromosoma X no permite la recombinación (excepto en las regiones pseudoautosómicas, PAR), y por lo tanto se transmite casi sin cambios a sus descendientes del sexo femenino permitiendo la determinación directa de haplotipos. Por otro lado, la presencia en las mujeres de dos copias del cromosoma X permite que durante la meiosis la recombinación tenga lugar a lo largo de todo el cromosoma. Son estas especiales características de su herencia las que hacen que este cromosoma sea relevante en aplicaciones de la genética forense y poblacional, así como en otras áreas de investigación tales como estudios de evolución humana y genética médica. Además de por sus distintas formas de herencia, los marcadores genéticos pueden clasificarse atendiendo a otras características. Así, dependiendo de la variación estructural que presentan, pueden clasificarse en polimorfismos de tamaño o de secuencia. Los Doctoral thesis - Iva Gomes 173 polimorfismos de tamaño, como los Short Tandem Repeats (STRs), constituyen uno de los diferentes tipos de variación existente en el genoma humano. Los polimorfismos resultantes de sustituciones de un solo nucleótido, Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), y la inserción o deleción de uno o más pares de bases, Insertion-Deletions (INDELs), representan otras formas de variación de la molécula de ADN. A pesar de la gran diversidad de polimorfismos disponibles, en el campo de identificación humana los STRs son, sin duda, los más utlizados. Algunas de las características principales que justifican la importancia de los STRs son: (i) el elevado grado de polimorfismo y la correspondiente capacidad de discriminar individuos (ii) la rapidez y la simplicidad de los métodos de análisis disponibles, con base en la tecnología de PCR y electroforesis capilar automatizada y (iii) la susceptibilidad para su incorporación en multiplexes permitiendo el estudio de un elevado número de marcadores a la vez. Como ocurre con cualquier otro STR del genoma, la selección de estos marcadores en el cromosoma X con fines de investigación forense, debe cumplir ciertos requisitos. Concretamente, cuando se pretende seleccionar un conjunto de X-STRs es importante tener en cuenta el grado de polimorfismo que presentan, su conformidad respecto al equilibrio de Hardy-Weinberg y el desequilibrio de ligamiento entre loci. También, siempre que sea posible, deben seleccionarse marcadores neutros (sin relación conocida con enfermedades u otros efectos fenotípicos). La combinación de las propiedades de los STRs conjuntamente con las características genéticas del cromosoma X justifica el potencial de la aplicación de marcadores X-STRs en genética de poblaciones y forense. Ha sido claro el incremento de los trabajos que utilizan polimorfismos X-STRs en estas áreas durante los últimos años en las publicaciones científicas (Pepinski et al. 2005; Shin et al. 2005; Gomes et al. 2006; Kang and Li, 2006; Aler et al. 2007; Gomes et al. 2007a; Gomes et al. 2007b; Hatsch et al. 2007; Szibor, 2007; Turrina et al. 2007a; Turrina et al. 2007b; Gomes et al. 2008; Gomes et al. 2009a; Gomes et al. 2009b; Gomes et al. 2009c; Gomes et al. 2009d; Gusmão et al. 2009; Diegoli et al. 2010; Poetsch et al. 2010). Objetivos Doctoral thesis - Iva Gomes 174 El trabajo descrito en esta tesis se centró en el estudio de marcadores genéticos localizados en el cromosoma X y sus potenciales aplicaciones en genética forense. Hasta el inicio de este proyecto solamente un pequeño número de polimorfismos localizados en el cromosoma X estaban descritos y un número muy limitado de poblaciones habían sido analizadas para estos marcadores. Consecuentemente, la falta de datos y estudios poblacionales en marcadores X-STRs justifica la necesidad de estudiarlos. Además de este objetivo general, se establecieron los siguientes objetivos específicos: i) Seleccionar un conjunto de marcadores X-STRs altamente polimórficos para potenciales aplicaciones en identificación humana considerando las propiedades genéticas recomendadas por la International Society for Forensic Genetics (ISFG) (Bar et al. 1997); ii) Desarrollar y optimizar multiplexes para la amplificación del mayor número posible de marcadores X-STRs en una sola reacción PCR; iii) Caracterizar genéticamente varias poblaciones de diferentes áreas geográficas como Europa, América, África y Asia para los polimorfismos X-STRs; iv) Determinar el interés de los polimorfismos STRs del cromosoma X en identificación humana; v) Estudiar y analizar la variación de las estructuras de las secuencias de ADN para los marcadores X-STRs. Discusión de resultados Doctoral thesis - Iva Gomes 175 Todos los estudios realizados en este trabajo fueron organizados en dos secciones y los resultados obtenidos se discuten a continuación: 1- Polimorfismos específicos del cromosoma X: diversidad, perfiles genéticos y evaluación forense en poblaciones humanas. Métodos: Selección de STRs y Multiplexes Antes de la selección final de marcadores, en una primera fase, los X-STRs previamente descritos en la literatura fueron analizados y considerados para su posible selección (Gomes et al. 2007b). Para realizarla, se consideraron ciertas propiedades genéticas, tales como su grado de polimorfismo que presentan, su conformidad respecto al equilibrio de Hardy-Weinberg, el desequilibrio de ligamiento entre loci y, la exclusión de marcadores con repeticiones mono- o dinucleótidos. Después de evaluar estos requisitos, fueron seleccionados un grupo final de diez X-STRs altamente informativos para aplicaciones en identificación humana: ocho tetranucleótidos, DXS8378, DXS9898, HPRTB, GATA172D05, DXS7423, DXS6809, DXS7132 y DXS6789, y dos trinucleótidos, el DXS8377 y DXS101 (Gomes et al. 2007b). A continuación, se desarrolló y optimizó un sistema multiplex para amplificación de estos diez polimorfismos X-STRs en una sola reacción de PCR (Gomes et al. 2007b). Más tarde, en una segunda fase, fue optimizado un segundo multiplex X-STR, como parte de un estudio de colaboración del Grupo de Habla Español y Portuguesa de la ISFG (GHEP-ISFG) (Gusmão et al. 2008). En este trabajo, tres marcadores del primer multiplex, DXS8377, HPRTB y DXS101, fueron sustituidos por los tetranucleótidos DXS7133, GATA31E08 y DXS9902, mientras que los siete restantes X-STRs se superponen con los del primer sistema. La sustitución de los tres loci se basó en la observación de numerosos eventos de slippage para los trinucleótidos DXS8377 y DXS101 así como la posible vinculación del locus HPRTB a un trastorno recesivo, el síndrome de Lesch-Nyhan (Mansfield et al. 1993). Doctoral thesis - Iva Gomes 176 Los dos sistemas X decaplexes optimizados demostraron ser muy sólidos y de reproducción y implementación en otros laboratorios técnicamente sencilla (Gomes et al. 2007b; Gusmão et al. 2009). De hecho, el segundo múltiplex fue desarrollado con éxito utilizándose para el genotipado de poblaciones en 17 laboratorios diferentes de Iberia y América del Sur (Gusmão et al. 2009). Caracterización de poblaciones Se analizaron varios grupos poblacionales utilizando los dos sistemas X-STRs (Aler et al. 2007; Gomes et al. 2007a; Gomes et al. 2007b; Pereira et al. 2007; Gomes et al. 2009a; Gomes et al.. 2009c; Gusmão et al. 2009; Valente et al. 2009). Algunas poblaciones fueron estudiadas por primera vez para polimorfismos del cromosoma X, como los Estados Unidos (Afroamericanos, Asiáticos y Hispanos) (Gomes et al. 2007b), Norte de Portugal (Pereira et al. 2007), África (Uganda, Mozambique and Angola) (Gomes et al. 2007a; Gomes et al. 2009c) y gitanos Portugueses (Valente et al. 2009). En un estudio de colaboración organizado por el grupo GHEP-ISFG, se analizaron para 4426 cromosomas los 10 X-STRs en grupos poblacionales de América del Sur, Brasil, Argentina, Colombia y Costa Rica y de otras regiones europeas como España y Portugal Central (Gusmão et al. 2009). Todos los marcadores se revelaron altamente polimórficos en todas las poblaciones presentando elevados valores de diversidad génica. En eso sentido, DXS8377 y DXS6809 fueron observados como los marcadores más polimórficos, mientras que DXS7423 y DXS7133 fueron los loci menos discriminantes en las poblaciones estudiadas. Nuevos alelos y alelos inusuales Durante a caracterización genética de los marcadores X-STRs en una población amazónica del Brasil, fue identificado un polimorfismo de tipo INDEL con 18 pares de bases en la región upstream del locus GATA172D05 (uno de los X-STRs más utilizados en genética forense) (Rodrigues et al. 2009). En este trabajo, se desarrolló una estrategia de genotipado que permitió identificar un gran número de haplotipos diferentes en las Doctoral thesis - Iva Gomes 177 diversas poblaciones estudiadas (Brasileño del Amazonas, Norte de Portugal, África y Belém). Con os dados obtenidos en este estudio, se verificó que el poder informativo del marcador GATA172D05 para casos de grados de parentescos puede ser mejorado con la aplicación de la combinación de los dos tipos de polimorfismos- STR y INDEL. Los estudios genéticos poblacionales realizados para los X-STRs permitieron la detección de nuevos alelos en DXS7423 (Pereira et al. 2007), y DXS9898 y DXS6809 (Gomes et al. 2007a; Gomes et al. 2007b). También fueran detectados alelos nulos en GATA172D05 (Gomes et al. 2007b; Gusmão et al. 2009) y en DXS7133 (Gusmão et al. 2009). Alelos pocos frecuentes, tales como triples y dobles, también se observaron en GATA31E08 y DXS6809, respectivamente (Gusmão et al. 2009). Igualmente fue detectada en DXS9902, una inserción de una adenina extra en un tracto 9-mer poli-A de la región upstream de la secuencia del motivo de repetición (Gomes et al. 2009b; Gusmão et al. 2009). Equilibrio de Hardy-Weinberg En el proceso de caracterización genética de las poblaciones, se realizaron test de equilibrio de Hardy-Weinberg para analizar la conformidad de los marcadores en la población respecto a este parámetro genético poblacional. En dos estudios se observaron desvíos del equilibrio de Hardy-Weinberg: en DXS101 para una muestra española de Valencia (Aler et al. 2007), en DXS7423 para Galicia (Gusmão et al. 2009) y en DXS6809 para una muestra de Río de Janeiro (Gusmão et al. 2009). En el primer caso (DXS101) no fue excluida la posibilidad de la presencia de alelos nulos debido al exceso de homocigotos observados (más de 10%). Mientras que para los dos marcadores DXS7423 y DXS6809, los desvíos observados de Hardy-Weinberg fueran probablemente debidos a efectos de muestreo. Doctoral thesis - Iva Gomes 178 Subestructura Poblacional y Bases de Datos Se determinó la necesidad de crear bases de datos forenses, comunes o separadas, para algunos de los diferentes grupos poblacionales estudiados (Gomes et al. 2007a; Gomes et al. 2007b; Gusmão et al. 2009). Para los tres grupos de Norte Americanos estudiados, Afroamericanos, Asiáticos y Hispanos, no se puede utilizar una base de datos común que incluye los diez X-STRs caracterizados (Gomes et al. 2007b). Lo mismo se verifica para los tres grupos Africanos, Uganda, Angola y Mozambique, por lo tanto deben ser utilizadas bases de datos independientes para estas poblaciones (Gomes et al. 2007b). En este sentido, para las poblaciones ibéricas de Portugal, Galicia y Cantabria, se obtuvieron distancias genéticas significativas que apoyan tres bases de datos independientes para estos grupos (Gusmão et al. 2009). De igual forma, en la América del Sur, es necesaria la creación de bases de datos independientes para las poblaciones brasileñas de Río de Janeiro, São Paulo y Paraná. Por otro lado, en Argentina, una base de datos común podría ser utilizada para Buenos Aires, Entre Ríos, Río Negro y Córdoba, pero excluyendo la población de Misiones ya que se observaron distancias genéticas significativas entre este grupo y la poblaciones de Entre Ríos y Río Negro (Gusmão et al. 2009). Desequilibrio de Ligamiento Otro parámetro importante durante la caracterización genética de una población es testar el grado de asociación entre los loci en esa población (desequilibrio de ligamiento). En los casos en que se encontraron asociaciones significativas entre marcadores se calcularon las frecuencias haplotípicas directamente a partir de los datos poblacionales (Gomes et al. 2007a; Gomes et al. 2007b; Pereira et al. 2007; Gomes et al. 2009a; Gomes et al. 2009c; Gusmão et al. 2009; Valente et al. 2009). Se prestó especial atención a los marcadores DXS6809 y DXS6789 ya que se encuentran localizados en el cromosoma X a una distancia muy próxima (0,34 cM) y están descritos como parte del grupo haplotípico DXS6801-DXS6809-DXS6789 (Szibor et al. 2005). En los casos en que se obtuvieron asociaciones significativas, antes de aplicar correcciones estadísticas para test múltiples Doctoral thesis - Iva Gomes 179 (como Bonferroni, por ejemplo), se calcularon las frecuencias haplotípicas para estos dos marcadores (Gomes et al. 2007b; Pereira et al. 2007). Durante la caracterización genética de una muestra portuguesa de etnia gitana, se obtuvieron asociaciones significativas entre DXS6809 y DXS6789 y entre DXS6789 y DXS9898 (Valente et al. 2009), siendo este el primer estudio donde se reportó una asociación significativa entre el par DXS6789 y DXS9898. La detección de desequilibrio de ligamiento en las poblaciones relativamente recientes, como es lo caso de poblaciones de etnia gitana, no es inesperada ya que las aportaciones poblacionales recientes (probablemente) no permitieron que la recombinación eliminara esta asociación (Valente et al. 2009). Aunque los marcadores que se revelan asociados contribuyen a reducir el poder de discriminación de un sistema multiplex poseen, sin embargo, una ventaja importante en caso de análisis de parentesco gracias a la posibilidad de usar haplotipos. Utilidad de los X-STRs en la identificación humana Uno de los objetivos propuestos del proyecto fue valorar el uso de los marcadores STRs del cromosoma X en la identificación humana. En todos los estudios realizados, la utilidad para este fin de los marcadores X-STRs se analizó mediante el cálculo de parámetros de estimación forense para cada marcador individual así como para el conjunto de los diez X-STRs. Los elevados valores de probabilidades de exclusión cuando el padre, madre e hija son analizados así como los elevados valores de exclusión de un hombre al azar de la población como el padre, cuando solo están disponibles las muestras del presunto padre y de la hija, demostraron que los marcadores seleccionados en el cromosoma X son muy informativos y útiles para la identificación humana (Aler et al. 2007; Gomes et al. 2007a; Gomes et al. 2007b; Pereira et al. 2007; Gomes et al. 2009a; Gomes et al. 2009c; Gusmão et al. 2009; Valente et al. 2009). Los principales casos de parentesco donde los marcadores del cromosoma X pueden tener un papel central son en aquellos donde las muestras de la constelación común (padre/madre/hija) no están disponibles. En la mayoría de estos casos, la paternidad se investiga mediante el estudio Doctoral thesis - Iva Gomes 180 del ADN de familiares y en muchas de estas situaciones se estudian hermanastras (por vía paterna). En estos casos, al contrario de lo que ocurre con los marcadores autosómicos, el cromosoma X tienen el potencial de poder excluir la paternidad (dado que las hermanastras comparten los mismos alelos paternos). A la luz de estos casos, se observaron elevados poderes de exclusiones para hermanastras, con el mismo padre putativo, que confirman la utilidad de los X-STRs en estos tipos de análisis de parentesco. 2- Variación de la secuencia, la estructura de repetición y la nomenclatura en X- STRs. Durante el estudio de los perfiles genéticos de los marcadores X-STRs, se compararon las poblaciones analizadas con otras poblaciones de las que se tenían datos disponibles para los mismos marcadores. Se efectuaron cálculos de distancias genéticas y se obtuvieron en algunos casos resultados inesperados entre poblaciones genéticamente afines (Pereira et al. 2007). Estos resultados nos sugirieron la posible utilización de nomenclaturas diferentes para un mismo marcador (Szibor et al. 2003b; Gomes et al. 2007b; Pereira et al. 2007; Gomes et al. 2009d; Gusmão et al. 2009; Szibor et al. 2009). Así, en la caracterización de las muestras del Norte de Portugal se observaron resultados inesperados para el marcador DXS8377 (Pereira et al. 2007). Adicionalmente, durante un ejercicio control de calidad de la GHEP-ISFG, este marcador (DXS8377) junto con el locus HPRTB, mostraron problemas: en ambos polimorfismos los datos se agrupaban principalmente en dos grupos de resultados. La investigación detallada reveló que, de hecho, se estaban utilizando diferentes nomenclaturas alelicas para el marcador HPRTB (Szibor et al. 2009) y para el STR DXS8377 (Szibor et al. 2003a; Szibor et al. 2003b). Este caso reforzó la importancia de establecer nomenclaturas alélicas estandarizadas de forma precisa. Doctoral thesis - Iva Gomes 181 Uno de los objetivos del presente trabajo consistió en reunir datos que podrían ayudar a solucionar este problema, solventando las diferencias de nomenclatura detectadas para de este modo obtener resultados de genotipado más precisos, fiables y consistentes entre los diferentes grupos de trabajo que utilizan marcadores X-STRs. Con este fin, se recogieron datos de secuenciación en diferentes grupos poblacionales (Africanos, Asiáticos, Caucásicos, Afroamericanos y Hispanos) así como en muestras de chimpancé (Pan troglodytes). Además se compararon las secuencias del genoma del chimpancé y su variación intra-locus con secuencias de humanos para de este modo inferir la estructura ancestral del locus más probable, así como detectar regiones variables o estables (Gomes et al. 2008; Gomes et al. 2009b; Gomes et al. 2009d). Las recomendaciones actuales de la ISFG sobre la estructura y denominación de las nomenclaturas para los marcadores autosómicos y para los loci Y-STRs (Bar et al. 1997; Gill et al. 2001; Gusmão et al. 2006) fueron obviamente consideradas. Estas directrices se extendieron a los datos recogidos con el fin de definir la nomenclatura alélica más precisa para cada marcador X-STR estudiado. Se detectaron discrepancias en la nomenclatura descrita de algunos de los loci del cromosoma X, como DXS9902 y DXS7132 (Gomes et al. 2009b; Gomes et al. 2009d). Además, también se detectaran regiones variables que no habían sido observadas anteriormente, o que no estaban siendo consideradas, como fue el caso de los loci GATA31E08, GATA172D05 y DXS7423 (Gomes et al. 2009b; Gomes et al. 2009d). En DXS9902, se detectó un diferente motivo de repetición que añade una unidad repetitiva a la anterior nomenclatura utilizada. De este modo, fue sugerida una nueva nomenclatura para este marcador X-STR, (TAGA)n (Gomes et al. 2009b). Para el locus GATA31E08, también fue propuesta una nueva nomenclatura [(AGGG)n (AGAT)m] ya que se detectó una estructura variable adicional, AGGG, adyacente al motivo repetitivo AGAT, que añade dos repeticiones (Gomes et al. 2009d). En otros casos, aunque las nomenclaturas establecidas no eran las más exactas, se optó por sugerir no modificarlas para evitar de este modo confusión con las existentes (de acuerdo con las Doctoral thesis - Iva Gomes 182 recomendaciones de la ISFG). Estos fueron los casos de los sistemas GATA172D05 (Gomes et al. 2009d), DXS7132 y DXS7423 (Gomes et al. 2009b). Para el locus GATA172D05, se detectó, adyacente a la repetición TAGA, una región de variación upstream que añade una repetición. En el caso del STR DXS7132 se verificó que estaban descritas dos nomenclaturas distintas (las unidades repetitivas simples CTAT y TCTA) pero que no alteran el número de repeticiones en este locus. No obstante, mediante la comparación de los genomas chimpancé/humano se concluyó que el motivo CTAT es el más correcto una vez que este es la secuencia ancestral detectada en Pan troglodytes. En el locus DXS7423 se detectó para todos los alelos ocho una estructura TCCA de repetición simple y sin interrupciones. Este resultado sugiere que el tracto de ocho bases (tctgtcct) que está en la nomenclatura descrita, [(TCCA)3 tctgtcct (TCCA)n] y que no es considerado para la designación del alelo, debe de ser incluido. Esta parte del trabajo contribuyó en gran medida a clarificar uno de los aspectos más relevantes de la genética forense como es el establecimiento de una nomenclatura precisa. Conclusiones finales El estudio de los polimorfismos específicos del cromosoma X en este trabajo ha proporcionado nuevos datos que han ayudado a clarificar varias cuestiones en los campos de la investigación de genética de poblaciones y de la genética forense. Las conclusiones principales se pueden resumir en los siguientes puntos: i) El conjunto final de marcadores seleccionados X-STRs fueran estudiados es profundidad en este proyecto de investigación (DXS8378, DXS9902, DXS7132, DXS9898, DXS6809, DXS6789, DXS101, DXS7133, GATA172D05, HPRTB, GATA31E08, DXS8377 y DXS7423) destacando su elevado grado de polimorfismo (por tanto son útiles para distinguir individuos). Doctoral thesis - Iva Gomes 183 ii) Se han optimizado dos multiplexes de marcadores X-STRs para aplicaciones en genética de poblaciones y forense. Ambos sistemas son técnicamente muy sólidos y fácilmente reproducibles en otros laboratorios. La estrategia empleada para el desarrollo de los multiplexes permitió la amplificación simultánea de diez marcadores en una única reacción de PCR y con un máximo amplicón de 360 bp, lo que permite también la aplicación a casos de identificación humana limitados por ADN de baja quantidad y/o calidad. iii) Antes de su aplicación forense, el análisis de los polimorfismos del cromosoma X permitió la caracterización genética de diversos grupos humanos de varias regiones geográficas en Europa, América, África y Asia aso como el estudio de sus parámetros genéticos. De este modo, fueron construidas bases de datos para aplicaciones forenses para los marcadores seleccionados del cromosoma X, estando disponibles para varias aplicaciones en las áreas abordadas en este proyecto. El estudio de los perfiles genéticos en los análisis poblacionales contribuyeron a la detección de un alelo nulo en GATA172D05, de alelos inusuales, tales como alelos triples y dobles para los marcadores GATA31E08 y DXS6809, respectivamente, así como nuevos alelos en varios loci (DXS7423, DXS9898, DXS6809 y DXS9902). iv) Los elevados valores observados en los parámetros de eficacia forense confirmaron la aplicación potencial de los marcadores X-STRs seleccionados a casos de identificación humana, sobre todo en aquellos escenarios donde los marcadores del cromosoma X tienen un papel más relevante. La combinación de los diez loci del cromosoma X demostró ser una herramienta de identificación importante pudiendo utilizarse en casos de identificación humana, cuando el uso de otros marcadores del genoma no llegan a proporcionar una solución. v) Una de las principales contribuciones del presente estudio fue la elucidación de las nomenclaturas alélicas para algunos de los STRs del cromosoma X más comúnmente Doctoral thesis - Iva Gomes 184 aplicados en genética forense. Se analizaron secuencias de estos marcadores en varios grupos poblacionales humanos (Homo sapiens) y en chimpancés (Pan troglodytes) lo que permitió identificar regiones variables no detectadas previamente. Además, las comparaciones entre los genomas de ambas as especies ayudó a inferir la estructura ancestral de los diferentes locus de X-STR así como su estabilidad. Como principales resultados de esto estudio exhaustivo se sugirieron nuevas nomenclaturas para GATA31E08 y DXS9902 así como se aclararon discrepancias en las nomenclaturas previamente descritas para los loci GATA172D05, DXS7132 y DXS7423.