Estudo ultrastrutural e imunohistoquímico dos miofibroblastos da cavidade oral

Resumo

Estudio Inmunohistoquímico y Ultraestructural de los Miofibroblastos de la Cavidad Oral Resumen Abreviaturas FN: Factor de crescimento derivado das plaquetas. IFN: Interferão. TGF: Factor de transformação do crescimento. mRNA: RNA mensageiro. ADN: Ácido desoxirribonucleico TNF: Factor de necrose tumoral. EGF: Factor de crescimento epidérmico. IGF: Factor de crescimento insulínico. CTGF: Factor de crescimento do tecido conjuntivo. MMP: Metaloproteinases. FAP: Proteína de activação fibroblástica. KGF: Factor de crescimento de queratinócitos. TIMP: Factor Inibidor de metaloproteinases. ANG II: Angiotensina II. 1. INTRODUCCIÓN Los miofibroblastos son células que expresan la isoforma a-actina de la célula muscular lisa. Estas células exhiben características intermedias entre fibroblastos y células musculares lisas; sin embargo revelan una morfología similar al de los fibroblastos. Los miofibroblastos también han sido llamados de fibroblastos peri-tumoral, fibroblastos asociados al carcinoma y fibroblastos activos del estroma, pero hoy son comúnmente conocidos por miofibroblastos. Ellos se presentan como una pequeña subpoblación celular en casi todos los órganos y son capaces de expresar y secretar una gran cantidad de citocinas, factores de crecimiento, quimiocinas, hormonas, neurotransmisores, mediadores inflamatorios, proteínas de adhesión y proteínas de la MEC -matriz extracelular. Los miofibroblastos son también responsables por la alta producción de material colágeno, metaloproteinasas, gelatinases, glicosaminoglicanos y factores de crecimiento de hepatocitos y queratinocitos. Con base en su capacidad de expresar altos niveles de citocinas, matriz extracelular ya-actina del músculo liso vascular, el miofibroblasto desempeña una participación muy importante durante la inflamación, deposita tejido conectivo, r, esperándose que estos puedan contribuir a la respuesta fibrótica a través de los fenotipos característicos concernientes. Los miofibroblastos se caracterizan morfológicamente como células alargadas, fusiformes o estrelladas con un núcleo regular y central. Ellos presentan un prominente citoplasma de microfilamentos de actina (fibras de estrés), un retículo endoplasmático bien desarrollado y están conectados entre sí a través de nudos y adhesiones del tipo gap junctions. Estas células también establecen contactos con los componentes de la matriz extracelular a través de fibronexus, que es un complejo transmembrana formado por la actina, la fibronectina y la integrina. Los miofibroblastos son identificados a través de la expresión de aSMA. Este marcador citoplasmático se encuentra, además, en otros dos tipos de células: células musculares lisas y células mioepiteliales. La presencia de otros marcadores como la laminina, desmina, calponina, miosina del músculo liso, caldesmonina y proteína de activación de los fibroblastos ha sido utilizada para caracterizar los miofibroblastos, pero el patrón de expresión es variable y depende principalmente del origen, ubicación y condición patológica. Por consiguiente, a-SMA es el mejor marcador celular para la identificación de miofibroblastos, permitiendo identificar y supervisar el comportamiento de estas células en contextos clínicos y patológicos. Estas células pueden encontrarse en inúmeras situaciones, participando ya sea en procesos fisiológicos o bien en procesos patológicos. Los miofibroblastos contribuyen para el crecimiento y diferenciación de los tejidos y órganos, a través de la interacción con las células epiteliales, y también desempeñan un papel importante en el proceso de reparación, a través de la retracción de tejido de granulación y de la síntesis de MEC, incluyendo el colágeno, fibronectina y proteoglicanos. Sin embargo, si persisten estas células, una cantidad excesiva de colágeno se produce, lo que resulta en transtornos fibróticos tales como la fibrosis hepática y queloides. 2.OBJETIVOS En este trabajo, son observadas diferentes formas de expresión inmunocitoquímica, en diversos entornos clínicos. El objetivo fue establecer una escala progresiva de expresión biológica con alta aplicabilidad en el contexto clínico con respecto al diagnóstico de las principales patologías de la cavidad oral. Por lo tanto, son objetivos de este trabajo: 1. Caracterizar una muestra de las principales patologías de la cavidad oral. 2. Evaluar la expresión fenotípica de los miofibroblastos en las principales patologías de la cavidad oral a través de un panel de anticuerpos: alfa-actina, desmina, vimentina y P63. 3. Relacionar la intensidad de la inmunomarcación con la severidad de las principales lesiones de la cavidad oral. 3.MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. CARACTERIZACIÓN DE LA MUESTRA La muestra estudiada es formada por 90 personas, de la consulta de Medicina Dental, del Hospital Senhora da Oliveira Guimarães, en el norte de Portugal, entre los años 2003 y 2008. A todos los individuos se aplicó un protocolo de trabajo, previamente establecido, en el cual se han listado los principales elementos de su identidad, su historia clínica y la ubicación exacta de la cosecha. En las personas de los grupos I y II se registró también la información relativa a las patologías diagnosticadas. 3.2.EVALUACIÓN CLÍNICA La evaluación clínica se realizó a través de una anamnesis y de un examen objetivo. En la anamnesis, se ha elaborado un cuestionario sobre las principales patologías locales y sistémicas, presentes o pasadas, hábitos y terapéuticas. En el examen objetivo se ha realizado una observación clínica, intra y extraoral. En el examen extraoral, fueron descartados los principales cambios esqueléticos, de la piel y mucosas. En el examen intraoral, se evaluó las mucosas de revestimiento, masticatoria y especializada. Además se observó las principales inserciones de frenillos, tumefacciones, pigmentaciones exógenas y endógenas de los tejidos blandos y duros. A continuación, se completó un ficha clínica periodontal para los respectivos registros. El diagnóstico de periodontitis se basa en el índice de extensión y severidad. Las diversas patología de la cavidad oral se basaron en los diagnósticos anatomopatológicos. Después de la evaluación clínica y histopatológica, los individuos fueron asignados por sus grupos de estudio de la siguiente manera: Grupo I: Aquí han sido colocadas todas las personas que no manifestaron ninguna patología sistémica o localizada. Clínicamente se clasifican como clínicamente sanos y actuaron como grupo de control. Grupo II: Aquí han sido colocadas todas las personas que no han demostrado ninguna patología sistémica, pero que han todavía manifestado una pérdida de la inserción clínica de leve a moderada. Clínicamente se clasifican como personas con periodontitis leve a moderada y actuaron como grupo de periodontitis. La clasificación leve a moderada se basó en la clasificación de Armitage, 1999. Grupo III: Aquí han sido colocadas todas las personas que presentaron otras patologías de la cavidad oral, previamente diagnosticadas. Clínicamente fueron clasificadas de acuerdo con las distintas patologías y sirvieron de base para un estudio comparativo con los otros dos grupos. Las patologías estudiadas fueron: leucoplasia, carcinoma de células escamosas, liquen plano, fibroma, fibroma, hiperplasia fibroepitelial, épulis fibromatoso y épulis granulomatosa. 3.3.TÉCNICA DE COSECHA Los tejidos fueron recolectados en ambiente aséptico, por medio de la técnica de biopsia convencional al nivel de la región vestibular de los 3º y 4º cuadrantes, en la transición entre la encía libre (marginal) y encía adherida con tamaños que oscilaron entre 2x2mm y 10x5mm. Todas las biopsias se realizaron con anestesia loco-regional à base de lidocaína al 2%, después del consentimiento previo del paciente obtenido por escrito de manera informada y voluntaria, en formulario apropiado, aprobado por el comité de ética del Hospital Senhora da Oliveira -Guimarães. 3.4.FIJACIÓN Todos los tejidos estudiados en microscopía óptica fueron fijados con formaldehído tamponado al 10%, en una cantidad que representaba a lo menos diez veces el volumen del tejido fijado. Los tejidos estudiados en microscopía óptica fueron fijados en buffer cacodilato de sodio a 0,1 M (pH 7,4). En algunos casos se efectuó el procesamiento directo desde la fijación para la microscopía óptica. 3.5.PROCESAMIENTO 3.5.1. Procesamiento de tejidos para la microscopía electrónica A partir de las muestras incluidas en los bloques de parafina, se ha realizado una selección del área de mayor interés, que ha sido retirada, cuidadosamente, con la ayuda de un bisturí. El fragmento fue cortado en pedazos pequeños y se colocaron en xilol durante 24 horas para eliminar toda la parafina. Se procedió a una hidratación por una serie decreciente de alcoholes con pasajes de 1 hora por etanol al 100% y de 30 minutos por etanol al 90% y 70%, siempre con dos reemplazamientos para cada alcohol. A continuación, los fragmentos han sido sumergidos en buffer cacodilato de sodio a 0,1 M (pH 7,4) por 1 hora y 30 minutos, haciendo cambios en el buffer cada 30 minutos. Se procedió a la etapa de post-fijación durante 1 hora (a 4º C) con tetraóxido de osmio al 1%, en buffer cacodilato de sodio a 0,1 M (pH 7,4). Posteriormente, se llevó a cabo una deshidratación por serie de alcoholes de gradación creciente, con pasajes de 10 minutos en solución de etanol al 50%, 75%, 90% y 95%, siempre a una temperatura de 4º C, seguidas de tres pasajes, también de 10 minutos cada uno, en etanol absoluto. En el último reemplazamiento de etanol absoluto, el procesamiento ha sido realizado a temperatura ambiente. En seguida, dos pasajes más de 10 minutos cada uno, pero ahora por óxido de propileno. La impregnación de las muestras en la resina de inclusión consistió en presentar los fragmentos en mezclas de óxido de propileno y una resina tipo Epoxy (Epon ®) en las proporciones de 3:1, 1:1 y 1:3, respectivamente, con una duración de 1 hora en cada mezcla. Por último, los fragmentos fueron sumergidos en Epon puro, en el cual quedaron durante 1 hora a temperatura ambiente y durante 30 minutos a 50 º C. A esto se siguió la inclusión, realizada en moldes de goma los cuales, después de completados con un fragmento en cada extremo y llenos de Epon, fueron incubados en estufa a una temperatura de 60 º C durante 2 días para la polimerización de la resina. Los cortes ultrafinos fueron realizados con un bisturí de diamante, en un ultramicrótomo (Leica Ultracut ®), y fueron recogidos en mallas de cobre con 200 mesh. Se llevó a cabo manualmente, una doble contrastación de los cortes, sumergiéndose, en primer lugar, las mallas con los cortes en una solución salina de acetato de uranilo durante 20 minutos y posteriormente, en una solución de citrato de plomo durante 10 minutos. La observación se hizo en un microscopio electrónico de transmisión JEOL 100CXII, donde se efectuaron registros de algunas imágenes en forma de micrografías. 3.5.2. Procesamiento de tejidos en histoquímica 3.5.2.1. Coloración de Hematoxilina - Eosina La coloración de Hematoxilina-Eosina fue utilizada en todos los tejidos estudiados como primera coloración. Este procedimiento es el principal método histoquímico realizado en la rutina histopatológica, acompañando siempre las técnicas complementarias de diagnóstico como la inmunohistoquímica. Se utiliza puesto que es la técnica que nos proporciona una relación núcleo- citoplasma más fiable y porque es la que mejor demuestra la estructura del tejido. Esta es también una técnica capaz de exponer los elementos principales de tejidos: el núcleo, el citoplasma y el colágeno. Procedimiento técnico: Los tejidos se prepararon sobre la base del protocolo, establecido por el laboratorio de Anatomía Patológica y siguió los pasos que se detallan a continuación: Los tejidos fueron sometidos a tres baños sucesivos en xilol, con tan sólo 10 minutos por cada baño. En seguida, los tejidos fueron hidratados por una serie de alcoholes de gradación decreciente, respectivamente al 100%, 95%, 80%, 50% y, por último, fueron colocados en agua. Después de lavarse los tejidos, fueron coloreados con hematoxilina durante 3 minutos, y se lavó nuevamente en agua para colocarse en seguida en Ácido Clorhídrico para la diferenciación. Subsiguientemente fueron lavados con agua corriente durante 10 minutos y luego coloreados por la eosina durante 3 minutos. Después de coloreados por la eosina, las secciones fueron lavadas, se eliminó los excesos de colorante, y se incubaron en estufa durante 10 minutos. Después del secado de las secciones, se procedió a la montaje en medio resinoso (Entellan ®). 3.5.2.2. Tricrómico de Masson Especial Esta coloración especial fue muy importante en la identificación de las fibrillas de colágeno y su ubicación, para la comprensión de los procesos patológicos asociados a los miofibroblastos, como la expresión del tejido conectivo en el proceso de reparación, y normalización de los cambios histológicos en respuesta a agresiones físicas o químicas. Procedimiento: Inicialmente se hizo una desparafinación, seguida por una hidratación y lavado. Los tejidos fueron lavados con agua destilada y coloreados con azul celeste durante 5 minutos. En seguida, los cortes fueron aclaradas y los núcleos fueron coloreados con hematoxilina de Gill durante 5 minutos. Los cortes fueron cubiertos con el alcohol pícrico durante 5 minutos y luego lavados abundantemente con agua corriente. Después de bien lavados, fueron coloreados durante 5 minutos por una solución de Ponceau-Fucsina. En seguida, fueron lavados con agua destilada y se colocaron en el mordiente Ácido Fosfomolíbdico al 1% durante 5 minutos. Los cortes fueron lavados nuevamente con agua destilada y coloreados por el azul de anilina durante un tiempo que osciló entre 2 a 5 minutos. En último lugar, y después de nuevo lavado con agua destilada, los tejidos fueron deshidratados, y diafanizados y en seguida se procedió a la montaje en medio resinoso. Los resultados encontrados en los diferentes cortes estaban en consonancia con la técnica clásica, es decir, los núcleos se tiñeron de azul oscuro, el colágeno de azul, las fibras musculares de rojo, los glóbulos rojos de color amarillo a naranja, los citoplasmas de rojo, las estructuras nerviosas de azul y el fibrinógeno de rojo oscuro. 3.5.3. TÉCNICA DE INMUNOHISTOQUÍMICA Los tejidos estudiados fueron sometidos a una técnica inmunohistoquímica para una evaluación de la presencia de actina, vimentina, desmina y p63, utilizando los anticuerpos NCL-SMA, NCL-L-VIM-572, NCL-DESM-DERII y NCL-p63 (mouse monoclonal antibody, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), respectivamente. Con este propósito, las láminas con cortes histológicas fueron desparafinadas durante 20 minutos en xilol y hidratadas por una serie decreciente de alcoholes hasta el agua (alcohol al 100% 5 minutos, alcohol al 100% 5 minutos, alcohol al 70% 5 minutos, alcohol al 50% 5 minutos y agua corriente 5 minutos). Las muestras utilizadas fueron fijadas con formaldehído tamponado al 10% e incluidas en parafina. El proceso de fijación de los tejidos en formaldehído proporciona la formación de enlaces cruzados que enmascaran los epítopes antigénicos. Por lo tanto, algunos anticuerpos requieren la recuperación antigénica para detectar a su epítope antigénico específico. En esta serie, con los anticuerpos anti-vimentina y anti-actina no fue necesario procederse a la recuperación antigénica ya que estos anticuerpos detectan a sus epítopes antigénicos específicos sin tener que romper los enlaces cruzados causados por la fijación en formaldehído. Sin embargo, para la detección de epítopes antigénicos p63 y desmina, fue necesario realizar la recuperación antigénica utilizando altas temperaturas. En este estudio, la recuperación antigénica se realizó con una solución comercial (RA Epitope Retrival Solution pH6, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) similar a la solución de tampón citrato original (10mm, pH = 6,0) en baño maría a 98° C durante 30 minutos. El sistema de detección utilizado para la reacción de inmunohistoquímica fue un kit de detección con polímero de peroxidasa (Novolink Polymer Detection System, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon Tyne, UK), y la detección de los diferentes tipos de anticuerpos se hizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante de este sistema de detección: Bloqueo de la Peroxidasa endógena con la Peroxidase Block, durante 5 minutos; inhibición de las reacciones inespecíficas con Protein Block, durante 5 minutos; incubación de los anticuerpos primarios (antiactina, dilución de 1/200 y incubación durante 15 minutos a temperatura ambiente; anti-desmina, dilución de 1/50 y incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos; anti-vimentina, dilución de 1/200 y incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos; anti-p63, dilución de 1/10 y incubación a temperatura ambiente durante 60 minutos); incubación del reactivo Post Primary Block, durante 30 minutos; Incubación con Polymer, durante 30 minutos; revelación con DAB, durante 5 minutos. Después de la marcación inmunohistoquímica, los cortes histológicos fueron contrastados con Hematoxilina, durante 2 minutos, deshidratados por una serie creciente de alcoholes (alcohol al 50% durante 2 minutos, alcohol al 80% durante 2 minutos, alcohol al 95% durante 2 minutos, dos veces alcohol al 100% durante 2 minutos), diafanizados en xilol y montados. La exactitud de la técnica de inmunohistoquímica depende de la obtención de una marcación muy específica previniendo así las reacciones inespecíficas del anticuerpo primario en el tejido. En la inmunohistoquímica es necesario garantizar que cada anticuerpo se usa en la dilución adecuada, que no se evapora durante la incubación y que es eliminado completamente, si no está ligado, antes de añadir el reactivo siguiente. Por este motivo, en cada ensayo realizado se incluyeron láminas con cortes histológicos de tejidos con la presencia de los epítopes antigénicos en cuestión y, antes de la realización de la técnica se procedió a la normalización de las condiciones más adecuadas, adaptándose a cada anticuerpo primario, el uso de la recuperación antigénica y el tiempo de incubación, la temperatura y la dilución del anticuerpo primario. La técnica se llevó a cabo en cámara húmeda y cada corte se aisló con pluma hidrofóbica. En cada reacción, se incluyeron cortes histológicos de apéndice íleocecal como control positivo para el anticuerpo anti-actina, anti-desmina antivimentina, y cortes histológicos de la próstata como control positivo para el anticuerpo anti-p63. 4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES El fenotipo del músculo liso que presenta las células mioepiteliales, es demostrado por la marcación positiva para la actina de la célula muscular lisa. Estos marcadores, en particular la a-actina, son fundamentales para la identificación de los miofibroblastos en un estroma complejo y, a veces, desmoplásico. En el contexto de la enfermedad periodontal es frecuente la expresión fenotípica de la a-actina por parte de los miofibroblastos, en particular en la encía adherida. La marcación del citoesqueleto es igualmente positiva para los filamentos de vimentina y desmina. Su expresión es clara, sin embargo, inferior a la observada para las personas que presentan patologías del tipo desmoplásico o incluso neoplásico (Grupo III). De los análisis realizados se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. Las principales patologías de la cavidad oral pueden ser acompañadas de una forma directa y proporcional por la expresión fenotípica de los miofibroblastos. 2. La intensidad de la inmunomarcación por la a-actina, desmina, vimentina y P63 es directamente proporcional a la severidad de las principales lesiones de la cavidad oral. 3. La intensidad de la inmunomarcación por la a-actina, desmina, vimentina y P63 es un factor importante de diagnóstico y pronóstico de las principales lesiones de la cavidad oral. 4. La inmunomarcación por la a-actina, desmina, vimentina y p63 es tendencialmente negativa en la ausencia de fenómenos proliferativos. 5. La inmunomarcación por la a-actina, muestra la evolución de la severidad de la enfermedad periodontal.