"Estudio mediante citometría de flujo y enzimoinmunoensayo de la respuesta inmune en ganado vacuno infestado por ""Hypoderma"" (DipteraOestridae)"

Resumo

En la actualidad, es manifiesta la ausencia de relación entre los niveles de inmunoglobulinas séricas y el grado de resistencia alcanzado por los animales infestados por Hypoderma spp, por lo que, se sospecha que la respuesta celular que ha sido menos investigada hasta el momento, juegue también un papel importante en la respuesta protectora frente a esta parasitosis. Este estudio se ha proyectado con el fin de profundizar en la respuesta inmune celular y humoral durante las distintas fases del ciclo de Hypoderma. Para ello se ha dividido la parte experimental en 3 apartados. En el primero se estudió mediante citometría de flujo, hematología y ELISA, la respuesta celular y humoral que se produce durante la fase esofágica de H. lineatum, empleando para ello animales infestados y no infestados sacrificados en matadero. La determinación de los niveles circulantes del antígeno hipodermina C no mostró diferencias significativas entre los grupos de animales analizados. Con respecto a las IgG totales y la subclase IgG1, se evidenciaron niveles significativamente más altos en las vacas que presentaban L-1 de H. lineatum respecto del grupo de animales adultos no infestados y de los terneros. Los niveles de IgG2 fueron menores en los terneros respecto de los adultos con y sin L-1 en la submucosa. Mediante ANOVA no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en las cifras de absorbancia de IgM de los tres grupos de animales del estudio. El análisis con la citometría de flujo de las poblaciones linfocitarias en sangre no evidenció diferencias entre los distintos grupos en cuanto al número de linfocitos T maduros (CD2+), colaboradores (CD4+) y citotóxicos (CD8+), mientras que en los ganglios mediastínicos se observó que el porcentaje de linfocitos T maduros era significativamente menor en los adultos no infestados respecto del grupo de los terneros, y que el porcentaje de linfocitos CD4+ y CD8+ era mayor en los terneros que en los dos grupos de adultos infestados. El predominio de los linfocitos CD4+ frente a los CD8+ durante la fase esofágica de H. lineatum indicaría que en este periodo, las respuestas de tipo inflamatorio y las de memoria dependen en gran medida de los linfocitos T colaboradores. En el segundo apartado, aplicando la citometría de flujo y también la hematología y ELISA, se hizo un análisis de la respuesta celular y humoral en el curso de las distintas fases del ciclo biológico de Hypoderma, para lo que se emplearon vacas Rubia Gallega con infestación natural. Se distribuyeron en 3 grupos de 7 animales cada uno: testigos no infestados, primoinfestados y reinfestados. Los niveles del antígeno hipodermina C en suero mantuvieron relación directa con las distintas fases del ciclo intraorgánico de Hypoderma. Así, en las fases iniciales, el tamaño reducido de las larvas condiciona un aumento moderado de los niveles de antígeno circulante, mientras que en fases posteriores, coincidiendo con la permanencia de las larvas en el esófago y su llegada al dorso, se alcanzaron los niveles máximos. La respuesta humoral durante el ciclo interno de Hypoderma siguió un modelo secuencial, de modo que las IgG2 aumentan con la llegada de las larvas al esófago, en tanto que las IgG1 incrementaron sus valores con la llegada de las larvas al dorso. Las IgG totales fueron relativamente altas durante la fase esofágica, y se mantuvieron así durante la permanencia de las larvas en el dorso. Los niveles de IgM apenas variaron a lo largo del ciclo de Hypoderma. Con respecto a las distintas poblaciones linfocitarias, se observó un aumento significativo de los CD2+ en los animales primoinfestados en el mes de enero, mientras que en los reinfestados hubo un descenso significativo en junio y un aumento en febrero. El porcentaje de linfocitos T CD4+ y CD8+ en el grupo de animales primoinfestados no experimentaron variaciones significativas en el periodo de estudio y por el contrario, en los grupos reinfestados se apreció un descenso en agosto; en el caso de los CD4+ también se observaron aumentos significativos en las tomas de octubre y febrero. Con la técnica posthoc Bonferroni no se hallaron diferencias entre los niveles de linfocitos CD2+, CD4+ y CD8+ en los grupos infestados. En suma, se ha evidenciado el predominio de los linfocitos colaboradores durante el ciclo de H. lineatum, en particular en los animales reinfestados, lo que indicaría la intervención de estas células en el desarrollo de resistencia frente al parásito. En este capítulo se ha incluido el análisis, mediante ELISA sándwich, de varias citoquinas típicas de una respuesta de tipo Th1 (factor de necrosis tumoral, interferon-gamma e interleuquina 12) y Th2 (interleuquina 10 e interleuquina 4). Una vez analizada la evolución de las distintas citoquinas se deduce que, en condiciones naturales, no se puede establecer un patrón de producción típico de una respuesta tipo 1 o tipo 2. Además la respuesta en los animales primo y reinfestados fue bastante similar para las citoquinas estudiadas, excepto para la IL-10 donde se observó una elevación más temprana en el ganado vacuno primoinfestado que en el reinfestado acompañada de mayor número de larvas que completaron su ciclo, lo que subrayaría el papel particular de esta citoquina como inhibidor de las respuestas inmunitarias del hospedador. El capítulo 3 incluyó un ensayo in vitro encaminado a estudiar el efecto inmunomodulador de los distintos antígenos larvarios de H. lineatum. Para su realización se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica de dos grupos de vacas (n=4) de Rubia Gallega del mismo rebaño empleado para el capítulo 2, es decir, sensibilizados y no sensibilizados frente a Hypoderma spp. El test de linfoproliferación mostró que la respuesta proliferativa debida al mitógeno concanavalina A en ausencia de antígeno, resultó más intensa en los cultivos de los terneros que en el caso de los individuos adultos previamente sensibilizados. Los índices de estimulación obtenidos con la hipodermina A fueron menores en todos los casos. Así pues, se evidenció la HyA como el antígeno que más inhibía la respuesta proliferativa, seguida por la HyB, la HyC y el ET. Al analizar, mediante ELISA sándwich en sobrenadantes de cultivos de CMSP, el efecto de los distintos antígenos sobre la producción de las citoquinas, se vió que la estimulación in vitro con HyA aumentaba la concentración de IFN-¿ en los cultivos procedentes de los animales no infestados y de los previamente sensibilizados, respecto de los estimulados únicamente con el mitógeno. Por el contrario, en las CMSP incubadas con HyB y estimuladas por el mitógeno no hubo variaciones sustanciales de la producción de IFN-¿ y tampoco la HyC determinó variaciones significativas de la producción de esta citoquina. Curiosamente, el cultivo en presencia del extracto crudo larvario disminuyó notablemente la producción del IFN-¿ en los animales no infestados y en los previamente sensibilizados. La estimulación de los cultivos con HyA disminuyó ligeramente la concentración de IL-4 en los animales sensibilizados y apenas la modificó en los no sensibilizados. De igual modo, incubación con la HyB y la HyC no originó cambios importantes en la producción de la IL-4 en ambos grupos de animales. La estimulación con HyA produjo un descenso significativo de los niveles de IL-10 en los no infestados y también en los ya sensibilizados. En cambio, no se hallaron diferencias significativas en los cultivos estimulados con HyB e HyC. De la misma forma, el cultivo en presencia del ET disminuyó significativamente la producción de IL-10 en todos los animales estudiados. El empleo del extracto total, fue seguido de un descenso considerable de la producción de las diferentes citoquinas lo que vendría a reflejar lo sucedido en las infestaciones naturales. Este estudio ha puesto de manifiesto que, sobre las células de los animales previamente estimulados, el efecto del extracto crudo fue menos acentuado que el ejercido por cada hipodermina por separado; esto nos llevaría a pensar que cada hipodermina produce efectos individuales que de alguna forma podrían llegar a solaparse e incluso limitar sus efectos.