Estudios de relajación por rmndinámica de dendrímeros, interacciones intermoleculares, supresión selectiva de señales y incremento de sensibilidad

Resumo

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) se ha convertido en una herramienta potente no solo para la determinación estructural, sino también para la caracterización de la dinámica molecular en una gran variedad de escalas de tiempo y para la detección de interacciones moleculares de variadas naturalezas. Estas informaciones se obtienen no sólo del desplazamiento químico, el parámetro que nos indica la energía de los niveles de espín entre los que se produce la transición, sino también del tiempo que los núcleos resonantes tardan en volver al equilibrio después de haber sido perturbados tras la aplicación de un pulso de radiofrecuencia. Tanto uno como el otro parámetro están intrínsecamente relacionados con un fenómeno fundamental de la RMN que es la relajación, en el cual se enmarcan los objetivos de esta Tesis Doctoral. El primer objetivo se refiere al estudio de la dinámica de dendrímeros por RMN. Los dendrímeros son un tipo de macromoléculas monodispersas, de arquitectura tridimensional altamente ramificada y regular que han despertado un gran interés en los últimos años, especialmente en campos como la biomedicina, la nanotecnología, y en procesos de transporte de fármacos. La RMN, además de ser una técnica fundamental en la caracterización estructural de estas macromoléculas, ha sido una de las técnicas más utilizada para estudiar su dinámica, de la que dependen muchas de sus propiedades y aplicaciones. Una gran cantidad de estos estudios se han basado en el análisis cualitativo de los parámetros de relajación, generalmente los tiempos de relajación longitudinal (T1) de protón. No obstante, estos estudios han resultado en conclusiones contradictorias a cerca de la dinámica de estas macromoléculas, lo que han avivado la falta de consenso acerca del modelo general que mejor describe la conformación de dendrímeros flexibles en disolución. Con el objetivo de aclarar esta cuestión y comprender en detalle la relación entre la variación de los tiempos de relajación en estructuras dendríticas y su interpretación en términos de dinámica, hemos realizado un estudio de relajación por RMN [1H and 13C T1, T2; 13C{1H}NOE; para distintos campos y temperaturas] de los dendrímeros de la familia poli(aril éter), que se presenta en el Capítulo 4. Estos dendrímeros constituyen una de las familias más estudiadas y un claro ejemplo donde los estudios de relajación por RMN conducen a conclusiones contrarias a las obtenidas mediante otras técnicas experimentales. Los estudios llevados a cabo en esta Tesis Doctoral revelan la existencia de profundas diferencias entre la relajación de dendrímeros y la de polímeros lineales, que a pesar de esto han servido erróneamente como base para interpretar cualitativamente los datos de relajación de dendrímeros. Como resultado de nuestra investigación se concluye que los dendrímeros presentan una dinámica lenta en las capas más internas que puede resultar en valores más elevados de T1 en el interior que en la periferia. Estas variaciones de T1 han sido erróneamente interpretadas como resultantes de una aumento de la movilidad interna de estas moléculas y una prueba de la validez del modelo conformacional dense-shell. Otro de los parámetro de relajación estudiados en el capítulo 4 fueron los tiempos de relajación transversales (T2). La diferencia entre la dinámica de las capas más internas y externas de dendrímeros resulta en una variación característica de T2 (aumento desde el interior hacia la periferia) que fue explotada para la simplificación del análisis de los espectros de RMN mediante el empleo de filtros de T2 como se demuestra en el capítulo 5. Estos experimentos han permitido realizar un filtrado por etapas desde las capas más internas del dendrímero hacia la periferia. El resultado es un experimento filtrado, en que al final se obtiene un espectro de RMN que muestra solo las capas más externas del dendrímero. Esta estrategia presenta utilidad en el análisis estructural de dendrímeros, especialmente durante el crecimiento del dendrímero o tras la funcionalización de los grupos de la periferia. Teniendo como punto común el fenómeno de la relajación, otra parte del trabajo de esta Tesis Doctoral se ha centrado en el incremento que las substancias paramagnéticas producen en las velocidades de relajación de especies diamagnéticas. Este efecto se ha utilizado para distintas aplicaciones. Las substancias paramagnéticas han sido utilizadas para hacer supresión selectiva de señales y simplificar el análisis de espectros de RMN. La simplificación de espectros de RMN puede ser muy útil, particularmente en el caso de muestras complejas como fluidos biológicos, extractos vegetales o formulaciones farmacéuticas, que contienen mucha información, pero su estudio es difícil debido a la gran superposición de señales de los distintos componentes. Las principales técnicas de simplificación de espectros están basadas en los filtros de relajación, como los filtros de T2 y los filtros de difusión. Sin embargo, en presencia de dos especies de tamaños similares estos experimentos no suelen ser eficaces debido a la pequeña diferencia de T2 y/o coeficientes de difusión traslacional. Con el objetivo de complementar estas técnicas, en 2007 nuestro grupo de investigación demostró la utilidad del ion paramagnético Gd3+ para llevar a cabo la supresión selectiva de señales en espectros de RMN (denominados filtros PSR). En este caso, la supresión no depende de la diferencia de tamaños entre las especies presentes en la mezcla, si no de su capacidad de complejar el metal paramagnético. Teniendo en cuenta la necesidad de predecir la selectividad de estos filtros, en el capítulo 6 se demuestra la viabilidad de la utilización del parámetro R2p (el incremento de relajación trasversal debido a la presencia del agente paramagnético) para predecir la selectividad de filtros PSR tras la adición de Gd3+, utilizando para ello diferentes muestras y formulaciones comerciales de interés en el campo farmacéutico, de alimentación y cosmética. El cambio producido en los tiempos de relajación de compuestos de bajo peso molecular tras su unión a macromoléculas ha sido ampliamente utilizado como medida de reconocimiento molecular. La unión de un grupo químico paramagnético a la macromolécula receptora ha permitido incrementar substancialmente la sensibilidad de este tipo de experimentos. Sin embargo, la necesidad de realizar previamente la unión covalente entre la especie paramagnética y la macromolécula receptora representan un gran inconveniente de esta metodología. En el capítulo 7 se presenta una alternativa simple para casos en los que se pretende identificar los ligandos que interaccionan de manera selectiva con macromoléculas que poseen grupos aniónicos capaces de unirse a Gd3+. Esta complejación produce un efecto paramagnético ¿selectivo¿ sobre las velocidades de relajación de los núcleos de la macromolécula, pero también de los ligandos que interaccionen con ella. Este método constituye una opción sencilla para la identificación de ligandos que interaccionan de manera selectiva con macromoléculas. Teniendo en cuenta este efecto se ha propuesto también una metodología para llevar a cabo la supresión selectiva de señales de aminas, poliaminas y polímeros no iónicos en espectros de RMN de mezclas, especies cuyas señales no se suprimen mediante la simple adición de Gd3+ (filtros PSR) descrita en el capítulo 6. El uso de agentes de relajación paramagnéticos ha sido también una alternativa muy extendida para incrementar la velocidad de adquisición de experimentos de RMN 1D y nD. Sin embargo, esta metodología presenta la desventaja de que, en la mayoría de los casos, el empleo del agente paramagnético supone la introducción de un contaminante lo que puede ser un problema cuando sea necesaria la recuperación/reutilización de la muestra. Con el objetivo de superar esta limitación, en el capítulo 8 se describe la utilización del O2 gas como agente de relajación paramagnético para incrementar la sensibilidad de experimentos 1D y 2D de RMN de polímeros y compuestos de bajo peso molecular en distintos disolventes.