Enteromixosis del rodaballoesclarecimiento de mecanismos patogénicos y rutas de la respuesta inmunitaria

Resumen

La enteromixosis representa una seria amenaza para el cultivo del rodaballo (Scophthalmus maximus) en Europa. La enfermedad provoca grandes pérdidas económicas asociadas a altas tasas de morbilidad y mortalidad en los lotes afectados y, en la actualidad, se desconocen medidas terapéuticas eficaces. El agente etiológico de esta enfermedad, Enteromyxum scophthalmi, es un mixosporidio parásito que infecta el epitelio de revestimiento digestivo del rodaballo y causa enteritis descamativa severa. Los mecanismos patogénicos de la enfermedad no están completamente esclarecidos, por lo que en la presente memoria, hemos progresado en el conocimiento de las lesiones asociadas a la parasitación por E. scophthalmi, aspectos de la respuesta inmunitaria y mecanismos implicados en la descamación epitelial. En primer lugar, hemos realizado una descripción histológica y ultraestructural de los cuadros lesionales durante las diferentes etapas de la infección. Los peces con infecciones leves no mostraron cambios histológicos evidentes. Se observaron estadios iniciales de desarrollo del mixosporidio en el epitelio digestivo sin una respuesta inflamatoria evidente por parte del hospedador. Las alteraciones más destacables fueron el incremento de células goblet y rodlet en el epitelio de revestimiento, y la detección de la enzima iNOS en el polo apical de enterocitos y en estructuras vasculares en bazo, reflejo de la activación de la respuesta inmunitaria innata. La aplicación de la técnica inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-E. scophthalmi permitió la identificación de estadios parasitarios iniciales, lo que supone una herramienta de diagnóstico temprano de la enfermedad en muestras fijadas y embebidas en parafina. En las infecciones moderadas, conforme se incrementó la carga parasitaria, aparecieron cambios histológicos en la mucosa digestiva. Se observó ondulación del epitelio de revestimiento como consecuencia de cambios morfológicos en los enterocitos, en algunos casos compatibles con apoptosis, confirmada mediante el inmunomarcaje de caspasa-3 activa. Además, en la lámina propia-submucosa aparecieron células inflamatorias, y en la base del epitelio, mayor cantidad de linfocitos intraepiteliales. Tanto en el infiltrado inflamatorio en el tracto gastrointestinal como en el tejido linfoide de riñón y bazo, se encontraron macrófagos y, en menor medida, granulocitos con inmunotinción positiva para iNOS. En las infecciones severas, los rodaballos mostraron desprendimiento del epitelio digestivo, quedando expuesta la membrana basal subepitelial, y presencia de células descamadas junto con formas parasitarias en la luz del tubo digestivo. Además de la apoptosis descrita previamente en el revestimiento epitelial, los enterocitos descamados sufrieron anoikis, un tipo de apoptosis desencadenada por pérdida de contacto con la membrana basal y/o células adyacentes. En el lumen intestinal, algunos mixosporidios se encontraban englobados por células epiteliales en anoikis. Teniendo en cuenta la escasez de esporas de E. scophthalmi que se observan durante las infecciones tanto naturales como experimentales, esta puede ser una estrategia válida para la dispersión de los estadios de desarrollo no esporulados, que permita colonizar otras zonas de epitelio o incluso infectar a otros rodaballos. En la infección severa se observaron abundantes células inflamatorias en la lámina propia-submucosa y, en contraste, intensa depleción leucocitaria sobre todo en el riñón anterior y el bazo. El infiltrado inflamatorio, principalmente mononuclear, estaba compuesto, entre otras células, por macrófagos que se inmunotiñeron intensamente para iNOS, pero además se detectaron muchas imágenes de apoptosis que se inmunomarcaron con caspasa-3 activa. Tanto el número de células que componían el infiltrado inflamatorio en la submucosa digestiva, como las células inmunomarcadas para iNOS fueron más abundantes conforme avanzó la infección. Un hecho destacable fue la presencia de centros de melanomacrófagos (CMMs) en la submucosa intestinal y en los órganos linfohematopoyéticos. En esta última localización, los CMMs fueron de mayor tamaño y se encontraban en mayor proporción que en los peces con infecciones leves. Además, en el bazo, la inmunotinción de iNOS demostró que las células que presentaban esta enzima tendían a agruparse en torno a estructuras vasculares y CMMs, precursores de los centros germinales de los linfonodos de mamíferos. Teniendo en cuenta que la enzima iNOS, productora de óxido nítrico, contribuye a crear un ambiente altamente oxidativo, es posible que la cantidad de células inflamatorias expresando iNOS en la lámina propia-submucosa dañe a las propias células del hospedador y promueva tanto el daño epitelial como la muerte celular de los leucocitos. Este hecho, junto con el incremento de apoptosis en el tejido linfoide y la migración masiva de leucocitos desde los órganos linfohematopoyéticos al foco inflamatorio, originaría o favorecería la depleción leucocitaria observada. Finalmente, con el objetivo de complementar el estudio de la respuesta del rodaballo frente a E. scophthalmi, se investigaron mediante inmunohistoquímica los cambios en la presencia de cinco moduladores en células enteroendocrinas y sistema nervioso entérico. Se sabe que el sistema neuroendocrino entérico y el sistema inmunitario están interrelacionados, y que en caso de agresiones en el tracto gastrointestinal, se producen interacciones bidireccionales encaminadas a la recuperación de la funcionalidad del tubo digestivo. En estudios previos, se ha demostrado que la infección por E. scophthalmi induce cambios en moduladores del sistema neuroendocrino entérico, que a su vez interacciona con el sistema inmunitario, por lo que el estudio del sistema neuroendocrino aporta información sobre el desarrollo de la respuesta sistémica del rodaballo. En el presente estudio, hemos observado una disminución de bombesina y glucagón, con efectos anorexigénicos, como posible estrategia para incrementar la ingesta de alimentos y mejorar la condición corporal. Por otra parte, el incremento de las encefalinas y somatostatina puede contrarrestar los efectos de la sustancia P sobre la motilidad y secreción de fluidos, ya que estos moduladores disminuyen estas acciones. Como consecuencia, se puede producir la acumulación de líquido que se observa en la inspección del tracto gastrointestinal en la necropsia de rodaballos severamente infectados. En contraposición, las encefalinas tienen efectos proinflamatorios que refuerzan la respuesta posiblemente exacerbada. Por último, el incremento de somastotatina supone, por una parte, la inhibición de la proliferación de leucocitos, cuya acción no es suficiente para retroalimentar la respuesta inmunitaria, y por otra, un posible factor participante en la descamación del revestimiento epitelial del intestino, por su acción antiproliferativa, en conjunción con la parasitación y los mecanismos de daño oxidativo previamente descritos.