Regulación de la expresión y función del receptor GPR55 en la homeostasis energética y metabólica

Zusammenfassung

Regulación de la expresión y función del receptor GPR55 en la homeostasis energética y metabólica Introducción: Existen mecanismos, moleculares, celulares y comportamentales implicados en la regulación de la ingesta de alimentos, el gasto de energía y la obesidad. En este sentido, la obesidad, se ha definido como el resultado de un almacenamiento de calorías que excede los requerimientos de energía del organismo, y en consecuencia, la interacción entre factores genéticos, medioambientales que la promueven y el sistema de control homeostático, contribuyen al desarrollo de diferentes tipos de obesidad, convirtiéndola en la enfermedad del siglo XXI (Morton et al., 2006). En el presente trabajo abordamos las funciones metabólicas desempeñadas por el sistema LPI/GPR55, dado que el receptor GPR55 es un receptor putativo cannabinoide y se sabe que el sistema endocannabinoide está involucrado en la regulación de la homeostasis energética (Rodriguez de Fonseca F. et al., 2005) (Di Marzo, 2006; Fowler et al., 2005; Ross, 2009). Objetivo general: Investigar las acciones de los ligandos putativos O-1602 y LPI del receptor GPR55 sobre la regulación de la ingesta y el control metabólico. Objetivos específicos: Determinar la regulación de los niveles de expresión del ARNm del receptor cannabinoide CB1 y del GPR55 en el tejido adiposo blanco e hígado en roedores en diferentes estadios fisiológicos relacionados con alteraciones en la homeostasis energética. Investigar los efectos metabólicos de la administración de O-1602 y LPI sobre la ingesta y la adiposidad en ratas. Determinar in vitro los efectos del tratamiento con O-1602 y LPI en células 3T3-L1. Investigar la expresión de CB1, CB2 y GPR55 en el tejido adiposo blanco e hígado de pacientes obesos y diabéticos y sus correlaciones con otros parámetros metabólicos. Determinar in vitro los efectos del tratamiento con LPI en explantes y adipocitos aislados de pacientes obesos. Materiales y Métodos: Para el estudio se utilizaron principalmente ratas macho (Rattus norvegicus) Sprague-dawley, así como otros modelos mutantes como la rata Zucker (carece del receptor de leptina) y la rata Dwarf (carece de GH). Adicionalmente se usaron muestras de ratones ob/ob (carecen de leptina) ratones knockout para GPR55 y muestras de tejidos humanos. Los animales fueron sometidos a distintos modelos metabólicos y farmacológicos, tras los cuales se sacrificaron y se les extrajeron los tejidos (tejido adiposo blanco e hígado) para llevar a cabo el estudio. Se analizó la expresión de los receptores cannabinoides CB1, GPR55 y CB2 mediante distintas técnicas entre las que se encuentran: RT-PCR en tiempo real y Western blot. El efecto de O-1602 sobre la movilización intracelular de calcio ([Ca2+]i) fue analizado en adipocitos diferenciados de 3T3-L1 mediante inmunofluorescencia. Adicionalmente para el estudio en humanos se realizaron análisis antropométricos, de composición corporal y determinaciones bioquímicas en plasma, así como también se analizó la expresión de CB1, CB2 y GPR55 y varios genes lipogénicos, mediante RT ¿PCR a tiempo real. Resultados: En nuestro estudio, en tejido adiposo blanco encontramos un marcado aumento en la expresión de mRNA de GPR55 y CB1, en los animales sometidos a ayuno y restricción alimenticia crónica en comparación con los animales alimentados ad libitum. El tratamiento con leptina a ratas en ayuno fue capaz de revertir los niveles de GPR55 y CB1 en gWAT. En estados de hiperleptinemia, tales como la obesidad inducida por la dieta y la gestación, los niveles de ARNm de ambos receptores mostraron una clara reducción en gWAT. Cambios en el eje hipofiso-adrenal mostraron que la expresión del receptor CB1 y del GPR55 no fue modificada después de la ADX; indicando que la glándula adrenal no es importante en la regulación de estos dos receptores en WAT. En cuanto al eje hipofiso-tiroideo sabemos que las hormonas tiroideas (T4, T3) son potentes moduladores de la homeostasis energética, por tanto, nuestros resultados indican que el hipertiroidismo desempeña un importante papel inhibidor en la regulación del receptor CB1 y tal vez en el de GPR55 en WAT, aunque en este último caso los datos no son estadísticamente significativos. Por su parte, sabemos que la GH tiene efectos sobre el tejido adiposo y la composición corporal, nuestros datos en ratas deficientes de GH (Dwarf) no mostraron diferencias en la expresión de CB1 ni de GPR55 lo que sugiere que la carencia de GH no es relevante para estos dos receptores en WAT. Por otra parte nuestros datos indican que la expresión génica de GPR55 y de CB1 se incrementa a lo largo del desarrollo postnatal en ratas machos y hembras. Nuestros estudios sugieren que la expresión génica de CB1 en gWAT está regulada tanto por la testosterona como por los estrógenos, pero por otra parte, la expresión de GPR55 en gWAT está específicamente modulada por la testosterona. Adicionalmente nuestros análisis en hígado de ratas, muestran un marcado incremento en la expresión de los dos genes durante estados de ayuno o de restricción alimenticia. De acuerdo con estos datos, la administración de leptina provocó una clara disminución en los niveles de expresión de mRNA de CB1 y GPR55 en el hígado, nuestros datos mostraron que la dieta alta en grasa promueve un aumento de los niveles del receptor cannabinoide CB1 y de GPR55 en el hígado, sin embargo estos cambios no llegaron a ser significativos. En cuanto a la expresión a nivel hepático de los dos genes, los machos parecen exhibir variaciones relevantes en función de las edades estudiadas, mientras que en el caso de GPR55 parece haber un incremento, aunque no significativo, a los 45 días. En el hígado de hembras adultas de 90 días, encontramos un incremento en la expresión de CB1 y GPR55. Por tanto, estos datos indican que los estrógenos, pero no la testosterona, podrían estar controlando la expresión hepática de estos receptores. Adicionalmente, encontramos que en roedores deficientes de la hormona GH, los niveles de expresión de mRNA del receptor cannabinoide CB1 y del GPR55 a nivel hepático no son diferentes respecto a su grupo control. Por tanto, este resultado sugiere que la GH no regula la expresión de ambos receptores en hígado. En este estudio hemos mostrado que el O-1602 regula la conducta alimentaria y el metabolismo del tejido adiposo. Más específicamente, encontramos que tanto la administración central como periférica aguda de O-1602 induce la ingesta de alimentos. Cuando se administra el O-1602 en la periferia, el efecto hiperfágico es transitorio, pero estos efectos son más marcados después de la administración central. El mecanismo por el cual se incrementa la ingesta de alimentos, implica la inhibición de niveles de mRNA y proteína de CART hipotalámico. Nuestros hallazgos demuestran que el tratamiento central con el O-1602 disminuye los niveles de ARNm del neuropéptido anorexigénico CART. De manera contraria, la expresión de pro-opiomelanocortina y los neuropéptidos orexigénicos NPY y AgRP permanecieron sin cambios. Por otra parte, nuestros resultados indican que la administración crónica central y periférica de O-1602, incrementa la masa grasa de manera independiente de la ingesta. Al medir la expresión génica de varias enzimas claves involucradas en el metabolismo de lípidos, transportadores de glucosa y adipoquinas implicadas en acciones inflamatorias, encontramos que la administración central crónica del O-1602 disminuyó específicamente la expresión de HSL (hormone sensitive lipase), GLUT1 y GLUT4 (Glucose transporter 1 - 4) en tejido adiposo blanco, en comparación con el grupo control. Por otra parte, la administración periférica subcrónica de O-1602 inhibió los niveles en la expresión de ATGL (adipose triglyceride lipase) en WAT, y esto se acompañó de un incremento en los niveles de genes relacionados con inflamación tales como, factor de necrosis tumoral (TNF-¿) e interlukina-6 (IL-6). La administración subcrónica periférica del O-1602 no causó alteraciones en la energía consumida ni en la actividad locomotora espontánea, sin embargo, si se incrementó el RQ durante la fase nocturna. Este hallazgo sugiere que una disminución en el porcentaje de la grasa utilizada sobre el consumo total de energía, el cual es independiente de la hiperfagia y del gasto energético. De acuerdo con estos hallazgos farmacológicos, los datos in vitro también indican que el O-1602 favorece la acumulación de lípidos en adipocitos. Nuestros experimentos indican que O-1602 aumenta los niveles de Ca2+ intracelular en células 3T3-L1. Así, tanto experimentos in vivo como in vitro, muestran que el O-1602 moduló el metabolismo de adipocitos, favoreciendo el almacenamiento de lípidos. Los experimentos realizados en ratones carentes de GPR55.mostraron que la inyección central de O-1602 incrementa la ingesta tanto en ratones normales como en ratones carentes de GPR55. Estos hallazgos sugieren que las acciones metabólicas desencadenadas por el O-1602 son independientes de GPR55 y podrían ser moduladas por otro receptor aún desconocido. Contrariamente a la administración de O-1602, la administración de LPI no afectó a ningún parámetro de la modulación de la homeóstasis energética. De manera más concreta, la administración aguda a nivel central y periférico de LPI, no provocó cambios en la ingesta de alimentos. Adicionalmente, la administración central y periférica subcrónica de LPI tampoco provocó variaciones en la masa grasa, y en consecuencia, no se observaron cambios en la transcripción de genes involucrados en el metabolismo de adipocitos. Por otra parte y de acuerdo con los datos in vivo donde LPI no afectó a la masa grasa, los datos in vitro indican que en adipocitos de células 3T3-L1, LPI no modifica la cantidad de lípidos en células 3T3-L1. Finalmente y acorde a los datos obtenidos en ratas, la administración intraperitoneal de LPI, tampoco provocó cambios sobre la ingesta en ratones carentes del gen GPR55, ni en sus controles wild type En cuanto a la regulación de gpr55, cb1 y cb2 en tejido adiposo blanco de humanos, nuestros resultados demuestran que el GPR55 se expresa en el tejido adiposo subcutáneo y visceral y también en hígado de humanos. Los datos, obtenidos a partir de dos cohortes independientes, indican que los niveles de mRNA de GRP55, están incrementados en tejido adiposo visceral y subcutáneo de los sujetos obesos en comparación con los sujetos delgados. Además, la expresión del GRP55 en tejido adiposo visceral está asociada positivamente con la diabetes tipo 2, pero no sucede lo mismo con el tejido adiposo subcutáneo. Los niveles del gen GPR55 en tejido adiposo visceral, guardan una mayor correlación con el peso, IMC y el porcentaje de grasa en mujeres que en hombres. Adicionalmente y de acuerdo con lo anterior, también en mujeres, los niveles de LPI en plasma están aumentados en pacientes obesas y se correlacionan positivamente con el peso, el IMC y el porcentaje de grasa corporal. Finalmente, en explantes obtenidos a partir de tejido adiposo visceral, el LPI estimula los niveles de ARNm de genes que promueven la lipogénesis, tales como ACC y FAS y en cultivos de adipocitos diferenciados obtenidos de tejido adiposo visceral, el LPI eleva los niveles de [Ca2+]i. Sin embargo, hemos encontrado que el LPI provoca respuestas menores en explantes de tejido adiposo o en cultivos de adipocitos diferenciados obtenidos a partir de tejido adiposo subcutáneo, sugiriendo que el sistema LPI/GPR55 es particularmente importante en el tejido adiposo visceral. Nuestros datos muestran que el ARNm de GPR55 se expresa en tejidos humanos y que su regulación es tejido específica, ya que la expresión de GPR55 en tejido adiposo blanco, pero no en hígado, es particularmente alta en pacientes diabéticos cuando se comparan con individuos obesos normoglicémicos. Encontramos mayores niveles de expresión de mRNA de CB1 en el tejido adiposo de pacientes obesos. De manera similar al CB1, los niveles de mRNA de CB2 y GPR55 en tejido adiposo visceral de sujetos obesos, también fueron incrementados. De manera similar a la expresión del GPR55, encontramos que los niveles de LPI en plasma están incrementados en los pacientes obesos, sugiriendo que el sistema GPR55/LPI está sobreactivado en estados obesos. Adicionalmente, al analizar hombres y mujeres de manera separada, el GPR55 en tejido adiposo visceral, muestra una marcada correlación con el peso, el IMC y el porcentaje de grasa en mujeres. De manera similar, la correlación de los niveles de LPI en plasma con el peso, el IMC y el porcentaje de grasa corporal fue también positiva en mujeres pero no en hombres. La correlación del LPI circulante y del GPR55 en tejido adiposo visceral con diferentes parámetros metabólicos sugiere que los estrógenos podrían ser relevantes para la vía de señalización de GPR55. En explantes obtenidos de tejido adiposo visceral, nuestros hallazgos indican que el LPI induce el almacenamiento de lípidos incrementando la expresión de genes lipogénicos y promueve la diferenciación de los adipocitos debido al incremento en la expresión de PPAR¿. Aunque el GPR55 también está presente en tejido adiposo subcutáneo, el tratamiento con LPI en explantes obtenidos del mismo tejido, no modificó la expresión de ninguno de los genes estudiados. De acuerdo con los estudios de expresión génica y la acción lipogéncia de [Ca2+]i en adipocitos (Gericke et al., 2009), el LPI provocó un incremento mucho mayor en los niveles de [Ca2+]i en cultivos de adipocitos diferenciados de tejido adiposo visceral que en los de tejido adiposo subcutáneo, tanto en términos de porcentaje de células sensibles como en la magnitud del aumento de [Ca2+]i. Adicionalmente al tejdido adiposo también estudiamos la expresión de GPR55 en hígado, sin embargo, entre los diversos subgrupos de pacientes obesos, no hemos encontrado cambios significativos en la expresión de este gen. Conclusiones: La expresión de ARNm de CB1 y GPR55 en hígado y WAT de roedores está regulada por el estado nutricional, el desarrollo postnatal, los esteroides sexuales y las hormonas tiroideas de manera tejido-específica. El O-1602 regula la conducta alimentaria y el metabolismo del tejido adiposo. De manera aguda incrementa la ingesta, mientras que la administración crónica incrementa la masa grasa. Estos efectos son independientes del GPR55. Además in vitro, el O-1602 incrementa los niveles de Ca2+ intracelular y el contenido de lípidos en adipocitos de células 3T3-L1. La expresión del GPR55 en tejido adiposo visceral y los niveles circulantes del LPI se correlacionan positivamente con el peso corporal, el IMC y el porcentaje de grasa corporal, particularmente en mujeres. El LPI incrementa los niveles de [Ca2+]i en adipocitos diferenciados de tejido adiposo visceral y la expresión de enzimas lipogénicas en explantes de tejido adiposo visceral.