Disrupted in schizophrenia 1 (DSIC1)regulation of the neuropeptide VGF and role in neurodevelopment and synapses

Resumen

Las enfermedades mentales tales como la esquizofrenia, el trastorno bipolar y la depresión son dolencias graves que afectan a un elevado porcentaje de la población mundial. En este sentido, se estima que aproximadamente un 7.4% de las causas de discapacidad global en adultos es debido a trastornos mentales y del comportamiento. Además, a parte de los efectos devastadores que estas enfermedades tienen tanto en los afectados como en su entorno más próximo, suponen un alto coste para toda la sociedad siendo la tercera condición médica más costosa del mundo. Un problema importante de estos trastornos es que a pesar de la gran cantidad de fármacos existentes, su tratamiento sigue teniendo importantes limitaciones. De hecho se calcula que un 30% de los pacientes no responden a estas drogas y además estas conllevan elevados efectos secundarios. La dificultad a la hora de desarrollar tratamientos más eficaces para este tipo de trastornos es en parte debida a su compleja etiología. Gracias a los estudios familiares, hoy en día, está claro que los factores heredables tienen un gran peso a la hora de medir el riesgo de padecer alguna enfermedad mental. Sin embargo, aunque pueden ser el resultado de la alteración de un gen concreto, en la mayoría de los casos estos trastornos se piensa que tienen un origen poligénico. A esto además, hay que sumarle un claro componente ambiental. Otra limitación son los sistemas de diagnóstico que se han estado utilizando hasta ahora. Estos tienden a crear límites estáticos entre las distintas enfermedades; sin embargo, las evidencias sugieren que las enfermedades mentales, aún tratándose de trastornos con una clínica muy distinta si comparten alteraciones en ciertos procesos clave para el buen funcionamiento del cerebro. Todos estos motivos hacen necesario una ampliación del conocimiento sobre la etiología de las enfermedades mentales y la identificación de desencadenantes comunes. En 1990 en una familia escocesa se descubrió una translocación ente los cromosomas 1 y 11 que cosegregaba con varios casos de esquizofrenia, depresión mayor, trastorno bipolar y otras enfermedades mentales menores. Posteriormente se demostró que dicha mutación es causal y su presencia incrementa de forma considerable el riesgo de padecer alguna de estas alteraciones. La translocación afecta a un gen presente en el cromosoma 1 que recibió el nombre de Disrupted in schizophrenia (DISC1). A día de hoy DISC1 es uno de los pocos genes considerados como de riesgo para el padecimiento de distintas enfermedades mentales en un elevado número de estudios independientes. En este sentido, desde su descubrimiento DISC1 demostró tener una relación causal con casos de esquizofrenia, trastornos esquizoafectivos, depresión mayor, trastorno bipolar o trastornos de espectro autista. La expresión de DISC1 es elevada en el cerebro durante el desarrollo embrionario y, aunque se reduce de forma considerable tras el nacimiento, en el cerebro adulto se puede encontrar también una elevada expresión del gen en el hipocampo y, más concretamente, en el giro dentado. La proteína codificada, la cual recibe el mismo nombre, también se puede encontrar en abundancia en áreas del córtex cerebral, bulbo olfatorio y cerebelo. DISC1 no tiene ninguna función enzimática conocida; sin embargo, las evidencias apuntan a que funciona como un andamio molecular que por interacción directa es capaz de regular en el tiempo y en el espacio la actividad de más de 100 proteínas distintas. Gracias a esta capacidad de unión, se ha demostrado que DISC1 tiene un papel importante en gran variedad de procesos esenciales para el correcto funcionamiento del cerebro incluyendo la proliferación y diferenciación neuronal, la migración celular o la formación y mantenimiento de las sinapsis. El objetivo principal de este estudio es profundizar en las funciones que DISC1 tiene en la célula para un mayor entendimiento de su implicación en las enfermedades mentales. Con este fin, se realizaron experimentos de silenciamiento o ¿knock-down¿ de DISC1 mediante RNA de interferencia. Para esto, lentivirus que contenían shRNAs (small hairpin RNAs) dirigidos contra la secuencia de DISC1, se usaron para infectar la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y y cultivos de neuronas de córtex e hipocampo de ratón. Como era de esperar dicha infección produjo en ambos modelos celulares el silenciamiento del gen y por tanto un marcado descenso en los niveles totales de proteína. En un estudio proteómico previo, el silenciamiento de DISC1 produjo un claro descenso de la cantidad de distintas isoformas del neuropéptido VGF (nombre no acronímico) en células SH-SY5Y. El gen Vgf se expresa en neuronas en el cerebro, la médula espinal y órganos neuroendocrinos. Una vez sintetizada, la proteína se procesa en las mismas neuronas dando lugar hasta a 10 péptidos con distintas actividades que son secretados de forma selectiva en respuesta a diferentes estímulos. Los péptidos derivados de VGF tienen un amplio abanico de funciones abarcando, por ejemplo, desde el control de la homeostasis energética hasta la regulación de procesos relacionados con la reproducción. Otro aspecto de VGF, que hace que sea importante su regulación por parte de DISC1, es que algunos de sus péptidos derivados actúan en el sistema nervioso como agentes neuroprotectores, estimuladores de la neurogénesis y potenciadores de la actividad sináptica. Gracias a estas características, VGF presenta probadas propiedades antidepresivas. Además, varios estudios apuntan a que alteraciones en VGF se encuentran presentes en los tejidos de algunos pacientes con depresión mayor, trastorno bipolar o esquizofrenia. De este modo, teniendo en cuenta que DISC1 y VGF presentan un patrón de expresión parecido, participan en procesos similares en neuronas y están relacionadas con las mismas enfermedades, el esclarecimiento de la ruta molecular que conecta ambas proteínas podría ser de gran importancia para la creación de nuevas terapias más efectivas para tratar los trastornos mentales. En el presente estudio se confirmó el descenso observado de VGF producido por el silenciamiento de DISC1 en células de neuroblastoma en neuronas primarias de ratón, un modelo más representativo de lo que sucede in vivo. Además se demostró cómo, de forma contraria, la inducción de la expresión de DISC1 también produce un incremento de los niveles de VGF. Para profundizar en el tema y tratar de identificar la ruta molecular que conecta a DISC1 con VGF, se comenzó por medir los niveles de diferentes moléculas inductoras de la expresión de VGF por "western blot" y se compararon dichas cantidades entre células control y células con DISC1 silenciado. Entre los principales estimuladores de la expresión de VGF se encuentra la neurotrofina BDNF (de sus siglas en inglés Brain Derived Neurotrophic Factor). En este estudio, la ausencia de DISC1 no produjo ningún cambio en los niveles de BDNF tanto en células SH-SY5Y como en neuronas indicando que, en este caso, BDNF no está implicado en el descenso de VGF observado en ambos modelos celulares. Al contrario, el ¿knock-down¿ de DISC1 resultó en los dos modelos en un claro descenso de los niveles de la forma activa (fosforilada) de CREB; un factor de transcripción necesario para la activación de la expresión de Vgf. Por lo tanto dicha disminución de la forma activa de CREB en la ausencia de DISC1 explica el marcado descenso de los niveles proteicos de VGF. Teniendo esto en cuenta se procedió al estudio por western blot de moléculas que regulan la actividad de CREB. AKT y ERK1/2 son dos quinasas que fosforilan directamente a CREB activándolo. El silenciamiento de DISC1 en neuronas de ratón no produjo ningún cambio en la cantidad total de ambas proteínas. Sin embargo, si se observó un descenso en la forma activa (fosforilada) de AKT en neuronas que fue confirmado en SH-SY5Y. Al contrario, la fosforilación activadora de ERK1/2 no experimentó ningún cambio en sus niveles. GSK3ß es otra conocida diana de AKT que a su vez también puede fosforilar a CREB participando en el control de su actividad. Por otro lado, DISC1 se une a GSK3ß inhibiéndola. Teniendo estos dos datos en cuenta, se investigó una posible implicación de GSK3ß en los efectos producidos por el ¿knock-down¿ de DISC1. En neuronas en las que DISC1 había sido previamente silenciado, se observó un inesperado descenso de la cantidad total de la proteína. También la fosforilación inhibidora de GSK3ß producida por AKT experimentó un descenso en concordancia con la observada caída de la activación de dicha quinasa. Sin embargo, la auto-fosforilación activadora de GSK3ß no sufrió ningún cambio significativo. De los resultados aquí presentados se puede extraer información sobre una nueva forma de regulación de GSK3ß por parte de DISC1 por medio de la regulación de sus niveles y/o su grado de fosforilación. Para comprobar si la disminución de VGF en las células en las que DISC1 fue suprimido se debe al aumento de la actividad de GSK3ß, se procedió a la inhibición de esta quinasa en neuronas primarias con el inhibidor selectivo CHIR-99021. Por western blot se comprobó que este tratamiento no tiene ningún efecto sobre la cantidad de VGF indicando que en este modelo GSK3ß no modula los niveles de expresión del neuropéptido. Otra molécula que regula la actividad de CREB es el segundo mensajero AMP cíclico (cAMP) que promueve la fosforilación de CREB por parte de la Proteína Quinasa A (PKA). Cuándo en la célula aumentan los niveles de cAMP la fosfodiesterasa 4 (PDE4) se activa e hidroliza dicho segundo mensajero. Curiosamente, DISC1 se une a distintas isoformas de esta familia de proteínas, secuestrándolas y manteniéndolas en un estado de baja actividad. Por tanto, la ausencia de DISC1 podría resultar en una activación excesiva de PDE4 provocando niveles de cAMP anormalmente bajos y por lo tanto produciendo un defecto en la activación de CREB. Para comprobar si el descenso en VGF se debe a una activación anormal de PDE4 las neuronas primarias se trataron con el inhibidor de PDE4 rolipram. Apoyando esta hipótesis, el tratamiento con rolipram produjo un aumento de los niveles de VGF aunque este no llegó a ser estadísticamente significativo. Con estos datos no se puede descartar la posibilidad de que bajo otras condiciones de tiempo y concentración del tratamiento, este podría producir un cambio significativo. Para seguir profundizando en la ruta que conecta DISC1 con VGF y sabiendo que CREB y AKT son dos eslabones implicados, se procedió a la inhibición de PI3K. Esta es una quinasa que cuando es activada provoca la fosforilación y activación de AKT. La inhibición de PI3K con el compuesto LY294002 resultó efectivamente en un descenso de los niveles de VGF en cultivos primarios neuronales. Esto podría indicar que DISC1 regula la cantidad de VGF en la célula a través de la ruta de señalización PI3K/AKT/CREB. Curiosamente, la ausencia de DISC1 resultó en un descenso de los niveles de Grb2 en SH-SY5Y, una proteína importante para la ruta de señalización de los receptores de neurotrofinas Trk. En este sentido, cuando dichos receptores son activados, reclutan a un grupo de proteínas, entre ellas Grb2 que es esencial para la activación de PI3K. Al contrario, el silenciamiento de DISC1 no llevó a ningún cambio en la cantidad total de Grb2 en neuronas primarias. Este resultado concuerda con los datos obtenidos previamente en otro estudio realizado en neuronas, en el que se demostró que aunque DISC1 no regula la cantidad de Grb2, si regula su distribución en la célula promoviendo el crecimiento de los axones. En el presente trabajo se propone un modelo según el cual o bien por la regulación de la localización de Grb2 en neuronas o de sus niveles en SH-SY5Y, DISC1 podría controlar la activación de PI3K regulando así la actividad de AKT y CREB y en consecuencia modulando la cantidad de VGF. En este trabajo también se incluyen los resultados obtenidos por el análisis proteómico de neuronas con DISC1 silenciado comparándolas con neuronas control. Para esto, los extractos celulares de cada una de estas condiciones fueron sometidas a electroforesis bidimensional en geles de poliacrilamida para la separación de las proteínas en función de su punto isoeléctrico y su peso molecular. Posteriormente las proteínas se tiñeron y los geles se analizaron por medio del software Ludesi REDFIN 3. Gracias a este programa se detectaron 68 ¿spots¿ con distinta intensidad entre los geles de las dos muestras (control y silenciado). Tras ser analizados por espectroscopía de masas estos ¿spots¿ resultaron corresponder a 48 proteínas diferentes. La validación por western blot mono y dimensional de alguna de estas proteínas permitió identificar modificaciones post-traduccionales diferencialmente reguladas dependiendo de la presencia o la ausencia de DISC1. Entre las proteínas identificadas, doce participan en distintos aspectos del neurodesarrollo. Este proceso comprende distintos eventos como la proliferación, la diferenciación o la migración neuronal que requieren una dinámica apropiada del citoesqueleto. Apoyando un papel para DISC1 en estos procesos, su silenciamiento causó diferencias notables en la expresión de un alto número de proteínas relacionadas con la organización y dinámica del citoesqueleto, el crecimiento de las neuritas y los axones o la migración neuronal. En concreto, los niveles de los principales componentes de los microtúbulos y los filamentos de actina, la tubulina y la actina respectivamente, sufrieron una clara disminución en aquellas células en las que DISC1 había sido silenciado. Por otro lado, varias proteínas de unión al citoesqueleto que regulan su dinámica también resultaron alteradas por la falta de DISC1 como por ejemplo MAP1B, LIS-1, distintas proteínas de la familia 14-3-3, CRMP-1 o la tropomiosina. Cabe señalar que la alteración de alguna de estas proteínas ya había sido previamente identificada como la causa de ciertas dolencias como por ejemplo LIS-1 cuya mutación causa lisencefalia. Por otro lado, en este estudio proteómico también se encontró otro grupo de doce proteínas cuya expresión se ve modificada por la ausencia de DISC1 que participan en la formación, la maduración y el mantenimiento de las sinapsis. En este grupo se encuentran entre otras la cadherina, la calreticulina o NCS. Junto a estas proteínas, también se identificaron otras importantes para el transporte de endosomas y de vesículas sinápticas como la sintaxina-7, MUNC-18 o diferentes proteínas Rab. Estos resultados indican un claro papel de DISC1 en la dinámica de estas vesículas esenciales para la comunicación entre neuronas. Es de destacar que siete de las proteínas que fueron identificadas por ser reguladas diferencialmente en ausencia de DISC1 en este estudio, comparten función tanto durante la el neurodesarrollo como en la sinapsis. Este es el caso de CRMP-2, CRMP-5, MAP1B, estatmina, cadherina-13, calreticulina y dinamina-1. Esto indica que ambos procesos no son completamente independientes y sugiere que DISC1 cuenta con un papel central en las neuronas desde el inicio de la neurogénesis hasta que estas ya son totalmente funcionales. Otro aspecto importante, es que algunas de las proteínas encontradas en este estudio pertenecen al ¿interactoma¿ de DISC1. Este es el caso de CRMP-2, MAP1B, 14-3-3¿ y LIS-1 cuya actividad puede ser modulada por su unión con DISC1. Sin embargo, esta es la primera vez que se describe que DISC1 también puede regular sus cantidades. Además cabe señalar que algunas de estas moléculas son conocidas por ser substratos de GSK3ß como CRMP-2, MAP1B y LIS-1. Como ya se comentó previamente, DISC1 se une a GSK3ß inhibiéndola, pero cuando esta unión se rompe, la quinasa queda liberada y tiene la capacidad de fosforilar a un amplio número de sustratos. De acuerdo con los resultados apuntados con anterioridad, el silenciamiento de DISC1 aparentemente produce la desregulación de la actividad de GSK3ß y por lo tanto a través de dicha quinasa, DISC1 podría también estar regulando la actividad de sus sustratos. En resumen, los resultados obtenidos en este estudio proteómico aportan una nueva vía de acción de DISC1 regulando los niveles de ciertas proteínas en neuronas que participan en el neurodesenvolvemento y la sinapsis. Por otro lado, los datos aquí presentados también apoyan las numerosas evidencias que sugieren que las enfermedades neuropsiquiátricas están causadas por alteraciones durante el neurodesarollo y en la sinapsis. Por último, se realizó un trabajo de medición del efecto de la ausencia de DISC1 en el crecimiento de neuritas. Para este propósito, células SH-SY5Y con un silenciamiento estable de DISC1 y células control fueron tratadas con ácido retinoico durante 7 y 14 días con la intención de inducir su diferenciación en células post-mitóticas de tipo neuronal. Esta transformación se debe a la expresión de proteínas neuronales como la proteína tau, el ß-amiloide o la transglutaminasa. Además, este cambio de expresión proteica va acompañado del crecimiento de neuritas. Tras el tratamiento y por medio de microscopía, se contó el número de células con neuritas con una longitud mayor que dos cuerpos celulares. Los resultados obtenidos indicaron que el silenciamiento de DISC1 produce un claro déficit en el crecimiento de neuritas en células SH-SY5Y tratadas con ácido retinoico, indicado por una importante reducción en el número y el tamaño de las mismas. Este defecto en la diferenciación de la línea celular concuerda con los datos obtenidos en el estudio proteómico en el que la falta de DISC1 conlleva cambios en los niveles de proteínas que participan en el crecimiento de neuritas en neuronas. Así, puede ser que en el caso de las células SH-SY5Y los cambios morfológicos observados tras la eliminación de DISC1 se deban a una desregulación de dichas proteínas. Por otro lado, otro importante efecto del ácido retinoico sobre las células SH-SY5Y es el aumento de la transcripción de TrkB, el receptor para BDNF. Como consecuencia, el ácido retinoico produce un incremento de la activación de la ruta PI3K/AKT. Como fue sido descrito anteriormente, el ¿knock-down¿ de DISC1 derivó en un importante descenso en la actividad de dicha ruta en los dos modelos celulares estudiados. De este modo, es lógico pensar que el efecto de DISC1 en el crecimiento de las neuritas también podría ser parcialmente mediado a través de VGF. DISC1 sería por lo tanto un importante factor en el mantenimiento de los niveles apropiados de VGF en neuronas necesarios para el correcto crecimiento das neuritas demostrando la existencia de un circuito regulador entre estas dos moléculas. En conclusión, de este trabajo se pueden extraer varias conclusiones. Primera: la falta de DISC1 produce una importante disminución de los niveles del precursor neuropeptídico VGF tanto en neuronas primarias de ratón como en la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y. Segunda: esta regulación de VGF por parte de DISC1 parece ser llevada a cabo a través de la ruta de señalización PI3K/AKT/CREB, independientemente de BNDF. Tercera: en células SH-SY5Y la ausencia de DISC1 produce un descenso de los niveles de Grb2, que es esencial para la activación de PI3K. Sin embargo, el silenciamiento de DISC1 no produce este efecto sobre los niveles de Grb2 en células de córtex e hipocampo de ratón. Cuarta: el silenciamiento de DISC1 produce cambios en la cantidad y nos niveles de fosforilación de GSK3ß en neuronas primarias de ratón. Esto parece indicar una desregulación de la actividad normal de dicha quinasa en la ausencia de DISC1. Sin embargo la inhibición de GSK3ß no tiene efectos sobre los niveles de VGF sugiriendo que esta quinasa no está directamente implicada en la modulación de los niveles de VGF por parte de DISC1. Quinta: el estudio proteómico aporta información sobre una nueva función de DISC1 regulando la cantidad total de proteínas relacionadas con el neurodesarrollo y la función sináptica. Sexta: el silenciamiento de DISC1 produce un déficit en el crecimiento de las neuritas en células SHSY5Y comparado con células control.