Desenvolvemento e aplicacion de metodos de analise por espectrometria de masas entandem para o estudio de metabolitos urinarios marcadores de erros conxenitos do metabolismo

Resumen

La detección de metabolitos anormales en la orina es importante para el diagnostico de muchos errores congénitos del metabolismo (ECM). En el presente trabajo se describe el desarrollo de métodos de análisis por espectrometría de masas en tandem con ionización por electrospray para detectar aminoácidos y acilcarnitinas en ionización positiva y acilglicinas, ácidos orgánicos, purinas y pirimidinas en ionización negativa en muestras de orina. Los tiempos de análisis fueron 2,6 e2,5 minutos por ensayo respectivamente, permitiendo el análisis diario de un elevado numero de muestras. Para ello se estudio y optimizo la fragmentación de un total de 57 moléculas marcadores de ECM, así como 23 patrones internos para su cuantificación dándose finalmente valores cuantitativos de 49 de ellos. Se estudiaron las interferencias presentes y se resolvieron cuando fue posible empleando transiciones alternativas. Posteriormente se establecieron los métodos de análisis, que se adaptaron a muestras de orina impregnadas en papel de filtro y se establecieron las estrategias de cuantificación. Se participo e un total d e5 programas de control de calidad externos, tres de ellos cuantitativos y dos cualitativos que permitieron contrastar la eficacia de los métodos, así como comparar los resultados obtenidos con las otras técnicas clásicas de análisis, principalmente GC-MS. Se calcularon los puntos de corte diagnósticos como percentiles luego del análisis de mas de 3000 muestras neonatales recogidas del programa de cribado. La validación diagnostica del método se realizo mediante el análisis de 290 muestras de pacientes, representando un total de 22 diferentes ECM. La MS/MS permite realizar de forma rápida, sensible y selectiva la determinación simultanea de un elevado numero de metabolitos en una muestra biológica compleja, como la orina, como una preparación de muestra mínima y sin la necesidad de separación cromatográfica previa, haciendo los procedimientos más rápidos y menos laboriosos que los métodos convencionales e detección de ECM. Los métodos de análisis desarrollados son utilizados actualmente como un complemento al cribado neonatal en muestras de sangre, funcionando de sangre, funcionando como pruebas de segundo nivel para reducir el número de falsos positivos y aumentar la eficacia de programas.