Complejos proteicos de membrana externa de " Neisseria meningitidis"análisis estructural y capacidad antigénica

Resumo

La infección meningocócica es importante problema de salud mundial, que causa muertes al año e importantes secuelas. De los principales serogrupos (A, B, C, Y y W135) causantes de la enfermedad, el serogrupo B es el único que no dispone de una vacuna eficaz. Las vacunas contra los serogrupos A, Y y W135 están constituidas por polisacáridos capsulares de estos serogrupos, y aún siendo efectivas, muestran algunos problemas como la escasa protección en niños, principal grupo de riesgo. La conjugación del polisacárido capsular contra el serogrupo C a una proteína transportadora ha supuesto un importante avance en la protección contra este serogrupo consiguiendo una buena protección en todos los grupos de edad. Sin embargo, la baja inmunogenicidad del polisacárido capsular del serogrupo B y la gran variabilidad antigénica que presentan los antígenos inmunodominantes subcapsulares han limitado la eficacia de las formulaciones probadas contra este serogrupo a la cepa homóloga con la que han sido elaboradas. A causa de estos problemas, en los últimos años se han desarrollado estrategias alternativas. Los principales candidatos obtenidos son proteínas o lipooligosacáridos de membrana externa, aunque los diseños ensayados, basados en proteínas purificadas, proteínas recombinantes sintetizadas a partir de secuencias genéticas o vesículas e membrana externa (OMVs) no han sido suficientemente efectivos o lo han sido contra cepas específicas. Nuestra hipótesis es que muchos de los epitopos importantes para la adquisición de la inmunidad natural que presenta la mayoría de la población adulta podrían ser de naturaleza conformacional y estar situados en complejos proteicos de membrana externa de los meningococos, no contemplados en muchos de los análisis en profundidad que actualmente se llevan a cabo. Por lo tanto, como objetivos planteados en este trabajo son el estudio del complexoma de membrana externa de N. meningitidis, la caracterización de los complejos proteicos más relevantes y el análisis de sus características antigénicas para finalmente se evaluar el interés de los complejos proteicos estudiados como antígenos vacunales frente al meningococo. Para al análisis del complexoma de la membrana externa de los meningococos hemos utilizado una novedosa técnica especialmente diseñada para este tipo de estudios denominada high resolution Clear Native Electrophoresis (hrCNE), así como las electroforesis bidimensionales nativa (2-D hrCNE/hrCNE) y desnaturalizante (2-D hrCNE/SDS-PAGE), caracterizando la composición de los complejos proteicos por espectrometría de masas. Posteriormente, tras conocer los principales complejos proteicos, se purificaron desde el gel por elución pasiva para obtener en ratones sueros inmunes anti-complejos, así como sueros inmunes anti-vesículas de membrana externa salvajes y mutantes, para analizar la funcionalidad de los anticuerpos generados. Los ensayos realizados con este fin fueron los ensayos de actividad bactericida del suero, de unión de anticuerpos a la superficie bacteriana, de deposición del componente del complemento C3b, de deposición del componente del complejo de ataque a membrana, y de actividad opsonofagocítica del suero, estos cuatro últimos medidos por citometría de flujo. El análisis proteómico reveló la idoneidad de las técnicas empleadas para el estudio del complexoma de la membrana externa de N. meningitidis, superando a otras previamente utilizadas en nuestro laboratorio, como la Blue Native Electrophoresis, y permitió detectar la presencia de 12 complejos proteicos mayoritarios. Tres de estos complejos son asociaciones homoméricas de las proteínas chaperonina de 60 kDa, glutamina sintetasa y cetol-ácido reductoisomerasa, y nueve son complejos de porinas, correspondientes a homómeros de la porina PorB y tres tipos de asociaciones heteroméricas de las porinas PorA y PorB, y las proteína RmpM: PorA/PorB, PorB/RmpM y PorA/PorB/RmpM. En menor proporción también se detectaron homómeros de PorA y complejos de alto peso molecular formados por PorA/PorB/RmpM/MIP. La existencia de esta gran diversidad de complejos proteicos de porinas sugiere, bien la presencia simultánea en la membrana externa de complejos con igual composición proteica pero con diferente estequiometría, o bien la participación de otras proteínas en dichos complejos. La utilización de cepas mutantes nos permitió también confirmar el papel crucial de la PorB en el mantenimiento de la integridad de los complejos de porinas. Del total de complejos detectados se obtuvieron cinco sueros anti-complejos: el suero anti-CxChap, obtenido tras la inmunización con el complejo de la chaperonina de 60 kDa, y los sueros anti-CxABR, anti-CxBR y anti-CxAB, anti-CxB, obtenidos tras la inmunización con los complejos formados por PorA/PorB/RmpM, PorB/RmpM y PorA/PorB y PorB respectivamente. Del mismo modo se obtuvieron sueros inmunes contra OMVs salvajes y defectivas en las proteínas PorA, PorB, RmpM o FetA. Todos los complejos purificados son accesibles en superficie e inducen respuestas que promueven la deposición del componente del complemento C3b, la formación del complejo de ataque a membrana y la actividad bactericida. La escasa reactividad cruzada de los sueros anti-complejos de porinas reduce su interés vacunal a la protección frente la cepa homóloga. La alta reactividad cruzada del suero anti-CxChap en los ensayos de unión de anticuerpos a superficie, deposición de C3b, deposición de MAC y actividad opsonofagocítica sugiere que las proteínas chaperonina de 60 kDa y MIP pueden ser antígenos con gran interés como componentes vacunales. La eliminación de la PorA (inmunodominante y variable) en las OMVs, así como de las proteínas PorB, RmpM o FetA, permite mantener una excelente unión de anticuerpos a superficie, deposición de complemento y actividad opsonofagocítica incluso contra las cepas heterólogas. Solamente la ausencia de anticuerpos contra la PorA produce la perdida de la actividad bactericida del suero anti-OMVs.