Estudio in vitro del potencial terapéutico de las ficotoxinas marinas en la enfermedad de Alzheimer

Zusammenfassung

El trabajo elaborado para la presente tesis doctoral se centra en el estudio del posible uso terapéutico de ficotoxinas marinas en la enfermedad de Alzheimer. La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa de carácter progresivo que afecta al 20 % de los ancianos de más de 80 años en España y con más de 35 millones de personas diagnosticadas con esta dolencia en todo el mundo en el año 2009. Clínicamente se caracteriza por una pérdida de memoria y capacidades cognitivas a medida que la enfermedad avanza y la atrofia cerebral y pérdida neuronal va siendo más marcada, que en los casos más severos puede llegar a interferir con las funciones cerebrales vitales. A nivel histopatológico y celular las dos características principales de esta dolencia son los depósitos de beta-amiloide, o placas amiloideas, y las marañas neurofibrilares de tau. Las primeras están formadas por acumulaciones del péptido beta-amiloide originados a partir de la ruptura anormal, vía amiloidogénica, de la proteína precursora de amiloide. Estos depósitos además de ser tóxicos para las neuronas ejercerán efectos tróficos sobre las células gliales lo que dará lugar a una respuesta inflamatoria. La otra patología característica de la enfermedad de Alzheimer son las marañas neurofibrilares de tau, compuestas por depósitos intracelulares de fibrillas insolubles de proteína tau hiperfosforilada. La proteína tau es un componente principal de los microtúbulos neuronales que participan en el mantenimiento de la estructura y el funcionamiento normal de las neuronas. Al fosforilarse en distintos residuos pierde su estructura y provoca la desorganización de los microtúbulos con la consiguiente disfunción celular que acabará produciendo muerte neuronal. Desde hace unos años el mundo científico ha visto en el fondo marino una gran fuente de nuevos compuestos con estructuras moleculares y mecanismos de acción muy diversos. El avance en el estudio de estas nuevas moléculas ha hecho de los compuestos marinos una interesante fuente de recursos para la industria farmacéutica, sobre todo teniendo en cuenta las tan diversas dianas celulares que poseen y el avance en las técnicas de síntesis para no depender solamente del medio natural. Las ficotoxinas marinas son un grupo de compuestos producidos por distintos dinoflagelados que cuando se produce una proliferación pueden llegar a acumularse en los moluscos filtradores o incluso en algunos peces provocando en algunos casos intoxicaciones en humanos y el cierre de las áreas de pesca o recogida para garantizar la seguridad de los consumidores. El estudio de los mecanismos de acción de estas toxinas para entre otras cosas el desarrollo de métodos funcionales de detección permitió profundizar en el conocimiento de sus actividades biológicas. En este trabajo doctoral aprovechamos el conocimiento de algunos de los efectos celulares de este grupo de compuestos marinos para testar su posible uso frente a las patologías celulares más características de Alzheimer, tau y beta-amiloide. Para ello se desarrolló un modelo in vitro de neuronas corticales primarias obtenidas a partir de animales transgénicos 3xTg-AD, modelo animal que presenta una sobreexpresión de tau y beta-amiloide. El modelo in vitro nos permitió hacer un cribado más rápido y con menos compuesto del que sería necesario usando el modelo in vivo directamente, al observarse en las neuronas corticales primarias transgénicas que también se expresaban la neuropatología celular de la enfermedad de Alzheimer y con un patrón temporal, aumentando la expresión en relación con el tiempo de cultivo. Dentro del amplio grupo de las ficotoxinas marinas, la presente tesis doctoral se centró en el estudio de los efectos del Gambierol, iminas cíclicas (Espirólidos y Gimnodimina) y la Yesotoxina en el modelo in vitro 3xTg-AD desarrollado. Observándose que el gambierol y dos compuestos análogos del mismo de 4 y 7 anillos producen una inhibición de las corrientes de potasio dependientes de voltaje. En el modelo celular 3xTg-AD nos encontramos con una sobreexpresión de las subunidades de potasio Kv3.1 que se reduce por la incubación de las células con gambierol. Esta incubación produce también una disminución de los niveles de tau hiperfosforilada y beta-amiloide relacionas inicialmente con una interacción de esta toxina marina con los canales de potasio dependientes de voltaje y los receptores glutamatérgicos NMDA. Las iminas cíclicas también produjeron una disminución de los niveles de tau hiperfosforilada, reconocidos por los anticuerpos AT8 y AT100, y los niveles de beta-amiloide celular. Pero en este caso se observó además una neuroproteción por parte de estos compuestos cuando se produce una agresión externa como es la presencia de glutamato a concentraciones que producen apoptosis. Estos compuestos cuya diana celular parecen ser los receptores colinérgicos produjeron además un aumento en los niveles de acetilcolina en lisados celulares. El 13 desmetil espirólido-C fue además testado in vivo donde se observó, tras aplicación intraperitoneal, un aumento de marcadores neuronales disminuidos en la enfermedad de Alzheimer, N-acetil aspartato y sinaptofisina, mediante H-MRN y western blot junto a la confirmación de la disminución de beta-amiloide en muestras de hipocampo. Estos datos además de constituir el primer perfil de metabolitos cerebrales por H-MRN en animales 3xTg-AD confirmaron la utilidad del modelo celular al reforzarse in vivo los resultados obtenidos in vitro previamente. Por su parte la yesotoxina produjo a concentraciones nanomolares una disminución de las dos características celulares de la enfermedad de Alzheimer anteriormente citadas, tau y beta-amiloide, unidas a una inhibición de la actividad de la quinasa GSK-3 y una translocación de la quinasa PKC del citosol a la membrana, lo que se corresponde con una activación de la misma. Los resultados obtenidos en este trabajo indican, por un lado, que el modelo in vitro de neuronas corticales primarias obtenido a partir de ratones 3xTg-AD proporciona un modelo celular útil para cribados farmacológicos iniciales de la enfermedad de Alzheimer. Y segundo, que los compuestos estudiados en la presente tesis doctoral, Gambierol, iminas cíclicas (Espirólido y Gimnodimina) y Yesotoxina son compuestos prometedores para estudios sobre su uso en estudios