Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad

Resumo

La diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune en la que las células ß de los islotes de Langerhans son selectivamente destruidas por linfocitos T autorreactivos específicos para antígenos propios de estas células (autoantígenos), disminuyéndose gravemente la cantidad de insulina secretada, lo que conduce a la patogenia de la enfermedad. Estos linfocitos T autorreactivos pueden haber sido generados por alteraciones en la tolerancia central y/o en la tolerancia periférica. Por todo ello en este trabajo de tesis nos hemos propuesto i) clonar, expresar y purificar autoantígenos importantes en la diabetes tipo 1 para desarrollar sistemas de detección de autoanticuerpos específicos contra ellos; ii) identificar los epitopos derivados del autoantígeno S100ß procesados y presentados de manera natural a linfocitos T por moléculas de histocompatibilidad que confieren susceptibilidad a padecer la enfermedad (HLA-DRB1*04:01 y HLA-A*02:01); y iii) estudiar la síntesis de galectinas en sujetos sanos y pacientes con diabetes tipo 1, ya que estas proteínas desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la tolerancia central y periférica. En el presente trabajo se han clonado, expresado y purificado los autoantígenos IGRP (subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa específica de los islotes), GFAP (proteína ácida de la glía) y S100ß, las dos últimas en cantidades y pureza suficientes como para llevar a cabo los experimentos subsiguientes. Se han desarrollado dos sistemas de ELISA para la detección de autoanticuerpos contra GFAP y S100ß: en el caso de GFAP la sensibilidad del ensayo es de 24,6% con una especificidad del 98,9% y un valor predictivo del 94,7%, existiendo diferencias significativas en la frecuencia de individuos positivos en pacientes con diabetes tipo 1 respecto de controles sanos, además de poseer aquéllos títulos de anticuerpo superiores, que correlacionan con el tiempo transcurrido desde el diagnóstico y con el número de complicaciones diabéticas. En lo que respecta a S100ß no existen diferencias ni en frecuencia de positividad ni en título de autoanticuerpos entre controles y pacientes. Sin embargo por western blot se ha detectado un tipo de autoanticuerpo presente exclusivamente en los pacientes diabéticos, que sugiere la presencia de una respuesta humoral diferente contra este autoantígeno en comparación con controles sanos. Se han identificado péptidos derivados del autoantígeno S100ß procesados y presentados de manera natural (PPPMN) tanto por la molécula de histocompatibilidad HLA-DRB1*04:01 (DR4) como por la molécula HLA-A*02:01 (A2.1). En el caso de DR4 se ha diseñado un sistema de presentación de antígeno en células homocigotas para DR4 a las que se les suministró S100ß, se han inmunopurificado las moléculas DR4, y los péptidos unidos a ellas han sido identificados por espectrometría de masas. Los 44 PPPMN identificados se solapan parcialmente, como era de esperar para una molécula de histocompatibilidad de clase II, constituyendo 3 regiones, de las que hemos diseñado 4 péptidos consenso: S100 6-25, S100 21-36, S100 25-46 y S100 68-92. En un ensayo de unión in vitro a DR4 se ha comprobado que S100 68-92 y, en menor medida, S100 6-25 se unen in vitro a DR4, siendo el complejo resultante estable, y se ha delimitado la posible secuencia de unión. A continuación se ha detectado la presencia de linfocitos T autorreactivos específicos para estos epitopos en controles sanos y pacientes diabéticos mediante ensayos de ELISPOT para las citocinas IFN-¿, IL-10 e IL-17. Los pacientes muestran un fenotipo claramente proinflamatorio, con linfocitos T autorreactivos específicos para los péptidos consenso de S100ß secretando IFN-¿ y, en menor medida, IL-17. Los controles muestran, sin embargo, un fenotipo inmunoregulador, secretando IL-10 en respuesta a estos péptidos, especialmente contra S100 68-92. En el caso de A2.1 se han generado células dobles transfectantes que expresan A2.1 y S100ß, de las cuales se han extraído los péptidos presentados por dichas moléculas de histocompatibilidad y se han identificado 5 PPPMN por espectrometría de masas. Mediante un ensayo in vitro se ha comprobado que al menos dos de los 5 PPPMN (S100 10-18 y S100 20-28) pueden haber sido generados por digestión en el proteosoma, un complejo multicatalítico clave en la generación de péptidos para su unión a moléculas de histocompatibilidad de clase I. Finalmente, hemos ensayado la capacidad de unión in vitro de estos PPPMN a la molécula A2.1, resultando que el péptido S100 10-18 se une con baja afinidad a la molécula de histocompatibilidad, característica compartida por otros péptidos derivados de autoantígenos descritos en la literatura. Se han generado además hibridomas a partir de linfocitos T infiltrantes de islotes de Langerhans de ratones NOD (no obesos diabéticos), el modelo animal de la diabetes tipo 1. Hemos comprobado que al menos 2 de los siete hibridomas generados son específicos de S100ß, ya que reconocen epitopos derivados de esta proteína presentados por moléculas de histocompatibilidad de clase II. Finalmente, y teniendo en cuenta el gran papel inmunoregulador que desempeñan las galectinas -1 y -3 al mantener la tolerancia central y periférica, en el presente trabajo se ha estudiado la síntesis de estas galectinas, en primer lugar, en diferentes subtipos de linfocitos T colaboradores (Th), y en segundo lugar en distintos tipos celulares de controles sanos y pacientes con diabetes tipo 1. En lo que respecta a los linfocitos Th, es el subtipo Th17 el que mayores niveles de galectina-1 y -3 produce, respecto de los linfocitos Th1 y Th2. En cuanto al estudio en controles sanos y pacientes con diabetes tipo 1, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes secretan menores cantidades de ambas galectinas respecto de controles sanos. La secreción reducida de galectina-1 es debida a células carentes del marcador CD4 (monocitos, linfocitos B y/o linfocitos T CD8+), reducción que supone una mayor resistencia de los linfocitos T autorreactivos a la muerte por apoptosis. Los linfocitos T CD4+ de diabéticos no presentan problemas de secreción de galectina-1, pero poseen niveles significativamente mayores de galectina-1 en superficie, que también conllevan una mayor resistencia a la muerte por apoptosis. Finalmente, los linfocitos T reguladores (Treg) de diabéticos poseen menores niveles de galectina-1 en superficie, probablemente reduciendo su poder supresor. Así pues en este trabajo de tesis se purifican autoantígenos importantes en la diabetes autoinmune, se desarrollan técnicas de ELISA para la detección de autoanticuerpos específicos contra ellos, se identifican PPPMN derivados de S100ß y presentados por moléculas de histocompatibilidad que confieren susceptibilidad a padecer la enfermedad, se detectan linfocitos T autorreactivos específicos para péptidos derivados de S100ß en pacientes diabéticos, se generan hibridomas de linfocitos T infiltrantes de ratón NOD que reconocen S100ß y se describen varios fallos en la síntesis de galectinas por parte de células de pacientes con diabetes tipo 1 respecto de controles sanos.