Estudio termodinámico de la heterogeneidad enzimática de la B-N-acetilhexosaminidasa en distintos medios biológicos

Abstract

ESTUDIO TERMODINÁMICO DE LA HETEROGENEIDAD ENZIMÁTICA DE LA beta-N-ACETILHEXOSAMINIDASA EN DISTINTOS MEDIOS BIOLÓGICOS La ß-N-acetilhexosaminidasa (Hex, EC 3.2.1.52) es una enzima lisosómica formada por dos subunidades polipeptídicas denominadas ¿ y ß, que son codificadas por dos genes diferentes. Las dos isoenzimas principales son el heterodímero ¿ß (isoenzima Hex A) y el homodímero ßß (isoenzima Hex B), mientras el homodímero ¿¿ (isoenzima Hex S) es inestable y tiene generalmente una limitada actividad catalítica. Otras formas enzimáticas como la Hex P, cuya actividad sérica aumenta en el embarazo y en la enfermedad hepática, así como las denominadas formas intermedias (Hex I) derivan de la isoenzima Hex B (ßß), por modificaciones post-traduccionales. Hace tan sólo unos años, la casi exclusiva aplicación clínica de la Hex era el diagnóstico bioquímico de gangliosidosis GM2 (enfermedad de Tay-Sachs y enfermedad de Sandhoff) y la detección de portadores heterocigotos. Sin embargo, estudios más recientes han puesto de manifiesto su gran interés en otras situaciones fisiopatológicas, hasta el punto de ser considerada como una de las pruebas de laboratorio que podría tener una amplia aplicabilidad en la práctica clínica (1). En 1988, Noto y cols sintetizaron la sal disódica del 3,3'-diclorofenolsulfonftaleinil-N-acetil-beta-D-glucosamínido (CPR-NAG) proponiéndolo como un substrato adecuado para la determinación de la Hex en orina (2). El CPR-NAG es hidrolizado por la Hex con liberación del aglicón (rojo de clorofenol, CPR), que presenta un máximo de absorción a 575 nm. Para la determinación de la actividad de la Hex la reacción enzimática se conduce a pH= 6.25, un valor intermedio entre el pH óptimo y el pH de máxima absorción del cromóforo (3). El estudio de la energía de activación (Ea) aparente de la Hex sérica, utilizando como substrato el CPR-NAG, puso de manifiesto una correlación altamente significativa de esta variable termodinámica con la proporción relativa de isoenzima Hex B (r= 0.957, p< 0.001), con una ecuación de regresión Hex B (%)= 3.0 Ea- 125.3. Asignando a la proporción relativa de isoenzima Hex B los valores extremos de 0 y 100 se obtuvo un valor estimado para la Ea de Hex A de 41.8 kJ/mol y para la Ea de Hex B de 75.1 kJ/mol, valores que presentan entre sí una diferencia altamente significativa (4). El valor estimado para la Ea de la isoenzima Hex B es igual al obtenido experimentalmente para la forma Hex P purificada de placenta humana, cuya desialilación con neuraminidasa no condujo a un cambio significativo de la Ea o de la actividad enzimática. Asimismo, en distintos sueros de pacientes en los que se había inactivado térmicamente la isoenzima Hex A, se obtuvo un valor medio para la Ea aparente de la Hex termorresistente (Hex B) de 75.2 kJ/mol, sin que el tratamiento con neuraminidasa produjese un cambio significativo de esta variable. Sin embargo, para la isoenzima Hex A purificada de placenta humana se obtuvo una Ea de 54.4 kJ/mol, significativamente mayor que el valor estimado para esta isoenzima mediante la ecuación de regresión antes indicada (41.8 kJ/mol). Este hecho se debería a una conversión parcial, por reordenamiento de las subunidades ¿ y ß, de la isoenzima Hex A tisular purificada en Hex B, un hecho ampliamente documentado y que fue confirmado electroforéticamente (4). El hecho de que la Ea de la isoenzima Hex B sea significativamente mayor que la de la Hex A se debería a la presencia en esta isoenzima de la subunidad ¿, cuyo centro catalítico es distinto al de la Hex B, y posibilita la determinación termodinámica de la composición isoenzimática de la Hex en distintos medios biológicos, tales como suero/plasma, orina, y lisados celulares. En este sentido, el que la desialilación de la Hex con neuraminidasa no produzca un cambio significativo de la Ea aparente es de una gran importancia, ya que la única diferencia entre la isoenzima Hex B y la forma Hex P es que esta presenta un mayor contenido de restos de ácido siálico en su molécula, y por tanto una Ea igual a la de Hex B. Con respecto a las denominadas formas intermedias (Hex I), presentando distintos grados de sialilación, tendrán Ea análogas a la de la isoenzima de que deriven (mayoritariamente Hex B). En el estudio que hemos realizado, y que se expone en la presente Memoria, se determinó termodinámicamente el perfil isoenzimático de la Hex en distintos tipos de muestras biológicas (suero, plasma, orina, plasma seminal así como en lisados de plaquetas, leucocitos totales no fraccionados y de poblaciones de mononucleares y polimorfonucleares) en diferentes situaciones fisiopatológicas. I. Factores de conversión de temperatura y composición isoenzimática de la beta-N-acetilhexosaminidasa El método termodinámico para la determinación de las isoenzimas de la Hex utilizando CPR-NAG como substrato implica la determinación por duplicado de la actividad de la Hex a cuatro temperaturas (25, 30, 35 y 37 ºC), lo que permite el cálculo de la Ea aparente con una adecuada precisión para su utilización con fines analíticos (CV<= 1.4%). Con vistas a una posible simplificación de la técnica y su adaptación a analizadores como el Hitachi 717, con posible selección de sólo dos temperaturas (30 y 37 ºC), se hizo una evaluación de la determinación de la composición isoenzimática de la Hex plasmática mediante el cálculo de los correspondientes factores de conversión de temperatura (FCT) 37/30 ºC y 37/25 ºC. Los FCT 37/25º C permitió la determinación de la composición isoenzimática de la Hex en 600 muestras de plasma, con unos resultados superponibles a los obtenidos mediante el cálculo de la Ea aparente utilizando las temperaturas de 25, 30, 35 y 37º C. Por el contrario, el uso de FCT 37/30º C no cumplió los mínimos de calidad exigidos, con un error estándar de la estima mucho mayor que el valor clínicamente aceptable. II. Efecto de la proteólisis parcial de los precursores de alta masa molecular y de las formas maduras de beta-N-acetilhexosaminidasa sobre su energía de activación aparente. Al igual que en el caso de otras enzimas lisosómicas, las subunidades alpha y betade la Hex son sintetizadas sobre los polisomas asociados al retículo endoplásmico rugoso, y el posterior plegamiento de las cadenas polipeptidicas, glicosilación, formación de enlaces disulfuro y dimerización, son etapas cuya finalidad es la vehiculización de la proenzima hasta los lisosomas. La unión de las subunidades es una etapa crítica, ya que su dimerización es necesaria para la adquisición de actividad catalítica (5, 6). En los lisosomas las cadenas polipeptídicas pro-alpha y pro-beta experimentan nuevos procesos proteolíticos y glicosídicos que las trasforman en las subunidades maduras (5-7). Consecuentemente, las formas precursoras de la Hex tienen un mayor peso molecular (Mr~ 150 kDa) que las formas maduras (Mr~ 120 kDa) (8), aunque estos procesos proteolíticos de las cadenas polipeptídicas no son un prerrequisito para la adquisición de actividad enzimática, siendo las formas precursoras catalíticamente activas (5, 6). Una pequeña proporción (5-20%) de los precursores enzimáticos de alta masa molecular recientemente sintetizados no se incorpora a los lisosomas y es secretada al medio extracelular (5, 6). En el presente apartado se estudió el efecto de la proteólisis parcial con papaína (EC 3.4.22.2) sobre la Ea de las isoenzimas de la Hex plasmática, urinaria, leucocitaria y plaquetaria. La digestión con papaína de la Hex plasmática (formas precursoras de alta masa molecular) produjo un incremento medio de la energía de activación aparente de 3.0 kJ/mol, debido a la proteólisis parcial de la molécula de Hex A, sin que se afectase la calidad catalítica de la isoenzima Hex B. Sin embargo, el tratamiento con papaína no modificó significativamente la Ea aparente de las formas enzimáticas maduras de baja masa molecular existentes en muestras de orina y lisados de leucocitos y plaquetas. En controles sanos (n= 11) y pacientes nefrológicos (n= 28), no se encontraron variaciones significativas de la Ea aparente de la Hex urinaria en la digestión con papaína, independientemente de la presencia de normo, micro o macroalbuminuria. Estos resultados confirman la hipótesis de que, incluso en pacientes con proteinuria, no existen en la orina formas enzimáticas de alta masa molecular de origen plasmático, siendo la actividad enzimática exclusivamente de origen tisular renal. III. Determinación termodinámica de las isoenzimas de beta-N-acetilhexosaminidasa en suero, plasma, plaquetas, leucocitos totales y subpoblaciones de mononucleares y polimorfonucleares. Los ensayos enzimáticos de la Hex son ampliamente utilizados para la detección de pacientes homocigotos y portadores heterocigotos de la enfermedad de Tay-Sachs. Los métodos de inactivación térmica que utilizan substratos fluorogénicos neutros como el 4-metilumbeliferil-N-acetilglucosaminido (4MU-NAG), son los más usados para determinar las isoenzimas Hex A y Hex B en suero y leucocitos (9-11), ya que bajo determinadas condiciones experimentales la isoenzima Hex B presenta una mayor termoestabilidad que Hex A. La mayoría de los laboratorios utilizan básicamente la proporción relativa en porcentaje de isoenzima Hex A en suero/plasma para definir un rango de normalidad, sin embargo algunos portadores heterocigotos de Tay-Sachs se situarían en una zona de solapamiento (10). Una alternativa aplicable cuando los resultados en suero no son concluyentes, es aislar leucocitos y realizar el tratamiento térmico de las isoenzimas en los lisados celulares (9, 10). Con la determinación de las isoenzimas de la Hex en poblaciones de leucocitos totales, mononucleares (MN), polimorfonucleares (PMN) (12, 13) o en plaquetas (14, 15) propuesta para el diagnóstico bioquímico de la enfermedad de Tay-sachs podría obtenerse una menor variación inter e intraindividual para la proporción relativa de isoenzima Hex A. La isoenzima Hex A también puede ser determinada de forma especifica utilizando el substrato fluorogénico negativo sulfatado 4-metilumbeliferil-N-acetilglucosaminido-SO4 (4MU-NAG-SO4); sin embargo, para el screening de grandes masas poblacionales este método no suele reemplazar a los de procedimientos de inactivación térmica debido al elevado costo del substrato sulfatado específico (10). El objetivo de nuestro estudio, fue determinar termodinámicamente el perfil isoenzimático de la Hex en suero, plasma, así como en lisados de plaquetas, leucocitos totales no fraccionados, y poblaciones de MN y PMN. La determinación de la energía de activación aparente de la ß-N-acetilhexosaminidasa permite la determinación simple y precisa de su perfil isoenzimático en lisados de plaquetas, leucocitos totales o en poblaciones de MN y PMN, con indudables ventajas en relación a los procedimientos tradicionales de inactivación térmica de la Hex A. El uso de lisados de leucocitos totales, en lugar de poblaciones celulares homogéneas (plaquetas, leucocitos MN o PMN), no parece introducir un aumento significativo de la variabilidad inter-individual de la proporción relativa de isoenzima Hex A, que es la variable utilizada para el diagnóstico bioquímico de pacientes homocigotos y detección de portadores heterocigotos de gangliosidosis GM2. IV. Caracterización termodinámica de la isoenzima A mutada de la beta-N-acetilhexosaminidasa en la gangliosidosis GM2 variante B1. Las gangliosidosis GM2 son enfermedades neurodegenerativas de carácter autosómico recesivo, causadas por la incapacidad para la metabolización del gangliósido GM2 por la isoenzima Hex A. Se pueden diferenciar tres tipos en función de la implicación de los distintos genes que codifican la subunidad alpha, con deficiencia de isoenzimas Hex A (variante B), la subunidad ß, con deficiencia de isoenzimas Hex A y Hex B (variante 0), y el activador proteico (variante AB) (16). Una variante del tipo B, denominada B1, se caracteriza por la presencia de una isoenzima Hex A mutada incapaz de hidrolizar el gangliósido GM2 y los substratos artificiales sulfatados (con carga negativa), debido a una disfuncionalidad catalítica del centro activo de la subunidad alpha. En los demás aspectos catalíticos, esta isoenzima mutada es aparentemente normal frente a los substratos artificiales neutros convencionales (9, 16-18). Como se indicó anteriormente, utilizando el substrato neutro CPR-NAG la Ea de la isoenzima Hex B (Ea¿ 75.1 kJ/mol) es significativamente mayor que la de la Hex A (Ea¿ 41.8 kJ/mol) debido a la presencia en esta de la subunidad alpha. Nuestro objetivo fue comprobar si este hecho podría permitir la caracterización termodinámica de la isoenzima Hex A mutada en la variante B1 de gangliosidosis GM2, una vez aislada a partir de diferentes medios biológicos de pacientes homocigotos. La isoenzima Hex A (¿ß) plasmática separada por cromatografía en DEAE-celulosa de un paciente con gangliosidosis GM2 variante B1, homocigoto para la mutación G533-A (Arg178His) denominada R178H, presentó una energía de activación (71.5 kJ/mol), significativamente mayor que la obtenida para la isoenzima A"normal" (41.3 kJ/mol). Al ser la subunidad ¿ inactiva, la actividad enzimática de la isoenzima A "mutada" derivaría exclusivamente de la subunidad ß, presentando una energía de activación análoga a la del homodímero ßß isoenzima B (73.8 kJ/mol). En los padres del paciente, el valor medio obtenido para la energía de activación de la isoenzima Hex A (55.4 kJ/mol), sugiere la presencia de una mezcla equimolecular de isoenzimas Hex A "mutada" y "normal" en el plasma de los portadores heterocigotos para la mutación R178H. V. Identificación bioquímica de pacientes homocigotos y portadores heterocigotos para la variante B1 de la gangliosidosis GM2. La deficiencia de Hex A producida por distintas mutaciones del gen que codifica la subunidad alpha (enfermedad de Tay-Sachs), comprende dos variantes enzimológicamente diferentes: variante B con ausencia de isoenzima Hex A y variante B1 con presencia de Hex A mutada que es catalíticamente inactiva frente al gangliósido GM2 y substratos artificiales con carga negativa, pero activa frente a substratos neutros. En contraste a la forma clásica aguda infantil de la variante B, la variante B1 es una forma subaguda con manifestación clínica más tardía entre los 3-10 años (5). Los estudios de las isoenzimas de la Hex mediante procedimientos de inactivación térmica de la Hex A o separación mediante técnicas electroforéticas o cromatográficas utilizando substratos cromogénicos o fluorogénicos neutros, no son adecuados para el diagnóstico bioquímico de homocigotos o la detección de heterocigotos portadores de la enfermedad de Tay-Sachs variante B1 (5, 10). Han de utilizarse substratos artificiales sulfatados negativos considerados específicos para la subunidad alpha (5, 6 ,10). En la variante B, la determinación de la actividad de Hex con un substrato neutro o de su inmunoreactividad antigénica proporciona datos similares, sugiriendo la ausencia de cantidades significativas de proteína enzimática inactiva (19). Sin embargo en la variante B1, la isoenzima Hex A mutada sería detectable inmunológicamente, aunque sea catalíticamente inactiva. El objetivo de nuestro estudio fue determinar la heterogeneidad enzimática de la Hex plasmática y leucocitaria en pacientes homocigotos y portadores heterocigotos para la gangliosidosis GM2 variante B1 mediante la determinación de su Ea aparente utilizando el substrato neutro CPR-NAG. La determinación de la Ea aparente de la Hex en lisados de leucocitos MN y PMN de 3 pacientes con gangliosidosis GM2 (2 variante B1 y 1 B1/B) y 6 portadores (los padres de los pacientes), demostró que el procedimiento puede ser aplicado con una elevada eficiencia al diagnóstico de pacientes y detección de portadores. La aplicación del método termodinámico a muestras de plasma demostró un alto poder discriminante para el diagnóstico de pacientes, pero no para la detección de portadores heterocigotos en los que pueden obtenerse falsos negativos. VI. Relación entre distintos marcadores de activación monocito / macrófago en la enfermedad de Gaucher tipo 1. La enfermedad de Gaucher es debida a una deficiencia hereditaria de la enzima lisosómica ß-glucosidasa (EC 3.2.1.45), con la consecuente acumulación de glicosilceramida en los lisosomas de los macrófagos (20, 21). Clínicamente, se han descrito tres formas de la enfermedad: tipo 1 no neuropática (la más común), tipo 2 neuropática aguda y tipo 3 neuropática subaguda. En los pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 1 las manifestaciones clínicas son resultado de una acumulación de macrófagos que causan aumento de tamaño y disfunción de hígado y bazo, y el acumulo de células de almacenamiento causa alteraciones en médula ósea y daño óseo (20). Quitotriosidasa (ChT), enzima convertina-angiotensina (ECA), adenosina deaminasa (ADA) y neopterina, son conocidos marcadores de activación monocito/macrófago en la enfermedad de Gaucher tipo 1. Asimismo, la Hex podría aumentar en algunos casos por activación macrofágica (22, 23), habiéndose descrito previamente aumentos de su actividad enzimática en suero/plasma de pacientes con enfermedad de Gaucher (24-26), lo que podría ser de utilidad para el diagnóstico de pacientes homocigotos y la detección de portadores heterocigotos (24). Nuestro objetivo fue estudiar las relaciones encontradas entre estos marcadores de activación monocito/macrófago en pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 1, y la posible utilización de la Hex en el diagnóstico bioquímico de esta enfermedad lisosómica. En 44 pacientes con enfermedad de Gaucher tipo 1 (no neuropático) se encontraron aumentados niveles séricos de los distintos marcadores de activación monocito/macrófago ensayados: quitotriosidasa > neopterina > enzima convertidora de la angiotensina > adenosina deaminasa > Hex, presentando una elevada correlación entre sí (p< 0.001). Sin embargo, el aumento de actividad Hex total en suero fue debido principalmente a incrementos de isoenzima Hex B, cuya correlación parcial (manteniendo Hex A constante) con los marcadores de activación monocito/macrófago no alcanzó la significación estadística. Esto sugiriere que el aumento de isoenzima Hex B es de origen hepatocitario, y en consecuencia la discreta elevación de actividad Hex total en la enfermedad de Gaucher tipo 1 sería consecuencia de la afectación hepática observada en estos pacientes. VII. Isoenzimas de la b-N-acetilhexosaminidasa en plasma y leucocitos de sangre periférica en la artritis reumatoide. Un reciente estudio sugiere que la degradación del cartílago en la artritis reumatoide depende, al menos parcialmente, del aumento de Hex, una enzima lisosomal que puede ser liberada al torrente sanguíneo (27). La actividad sérica de Hex está significativamente aumentada en algunos pacientes con artritis reumatoide (27, 28), y esto podría ser debido a una sobreproducción de enzima a nivel articular (27), ya que se ha observado un incremento de la actividad de Hex en cultivos de condrocitos articulares incubados con IL-1b (27, 29), una de las principales citoquinas prodegradativas en líquido sinovial. Consecuentemente, la Hex sérica podría ser un marcador de erosión independiente del estatus inflamatorio (27). Sin embargo, la actividad de la Hex en suero humano tiene un importante origen plaquetario (30), y en pacientes con artritis reumatoide el número de plaquetas circulantes está frecuentemente incrementado (31), lo que podría conducir a engañosos resultados. El objetivo de nuestro estudio fue evaluar los posibles aumentos de actividad de la Hex, así como de sus correspondientes isoenzimas Hex A y Hex B, en plasma y leucocitos periféricos de pacientes con artritis reumatoide, y su posible correlación con la actividad y severidad de la enfermedad. En los 51 pacientes con artritis reumatoide estudiados, se encontró una aumentada actividad plasmática de Hex total y su isoenzima Hex B, aunque no presentó una correlación significativa con la evaluación radiológica de la enfermedad (Sharp modificado), la capacidad funcional de los pacientes (Health Assessment Questionaire), el tiempo de evolución de la enfermedad, o los marcadores bioquímicos de inflamación, proteína C reactiva, ácido siálico, y velocidad sedimentación globular. La actividad plasmática de la Hex total, o incluso de sus isoenzimas Hex A y Hex B, no parece ser un marcador adecuado de erosión y degradación del cartílago en pacientes artríticos, cuya función hepática parece ser el determinante principal de los niveles de actividad enzimática. VIII. Relación entre la concentración plasmática de amonio y la actividad isoenzimática de la ß-N-acetilhexosaminidasa en la cirrosis hepática En las enfermedades hepáticas, la degeneración de las células parenquimatosas implica un incremento del número de lisosomas y de la actividad enzimática lisosomal (32). El incremento de actividad en suero/plasma de la Hex en pacientes con cirrosis o colestasis hepática es un hecho bien documentado (33-36). Los resultados obtenidos por Hultberg y cols en cultivos de fibroblastos humanos (37), en la línea celular de hepatoma Hep G2 (38) y en modelos experimentales en ratas (39), han puesto de manifiesto que el amoníaco puede favorecer la secreción de Hex al medio extracelular. Consiguientemente estos autores sugieren que el aumento de concentración de amonio en pacientes con enfermedades hepáticas podría contribuir a un incremento de la secreción y cesión de la enzima al plasma (37, 38). El objetivo de nuestro estudio fue la verificación de hipótesis formulada por estos autores. En 35 pacientes con cirrosis hepática estudiados, se encontró un aumento significativo de la actividad plasmática de la Hex total y sus isoenzimas Hex A y Hex B (p< 0.001). La correlación parcial, manteniendo otros marcadores bioquímicos de daño hepático constantes, de la proporción relativa de isoenzima B con la concentración de amonio plasmático fue altamente significativa (p< 0.001). En el curso de la enfermedad hepática, el catión lisosomotrópico NH4+ podría causar una inhibición de la maduración de las formas enzimáticas precursoras de alta masa molecular, interfiriendo en su trasporte al lisosoma y aumentando su secreción al medio extracelular. IX. Caracterización termodinámica de la composición isoenzimática de la ß-N-acetilhexosaminidasa en plasma seminal Aunque ya en 1986 Kapur y Gupta caracterizaron las isoenzimas Hex A y Hex B en plasma seminal humano (40), en trabajos posteriores sólo se prestó atención a la actividad enzimática total (41-44), habiéndose sugerido su utilización como un posible marcador bioquímico de azoospermia (43). Nuestro objetivo fue la determinación termodinámica de la composición isoenzimática de la Hex en plasma seminal y su eficiencia diagnostica en casos de azoospermia. En 86 plasma seminales se caracterizaron las isoenzimas Hex A y Hex B, presentando unas Ea de 41.5 kJ/mol y 72.3 kJ/mol respectivamente, lo cual posibilitó la determinación termodinámica del perfil isoenzimático en este medio biológico. Se encontró una diferencia significativa entre plasmas normozoospermicos y azoospermicos para la isoenzima Hex A, aunque con un considerable solapamiento entre ambos grupos. Se obtuvieron correlaciones significativas de la actividad enzimática Hex total y de las isoenzimas Hex A y Hex B con el número de espermatozoides inmóviles, y de la actividad Hex total e isoenzima Hex B con el número de espermatozoides muertos. Asimismo, la isoenzima Hex A presentó una correlación significativa con el número de espermatozoides vivos; sin embargo, la actividad enzimática de origen acrosómico parece poco importante desde un punto de vista cuantitativo. En consecuencia, no se ha podido confirmar que la Hex total o sus isoenzimas, sea un marcador adecuado de azoospermia. El procedimiento termodinámico desarrollado puede ser una alternativa válida para la determinación de la hetererogeneidad enzimática de la Hex en espermatozoides. X. Estudio comparativo de la ß-N-acetilhexosaminidasa urinaria con otros marcadores de daño renal en la poliquistosis renal autosómica dominante La poliquistosis renal autosómica dominante (PRAD), es la más común de las enfermedades hereditarias monogenéticas y afecta a 1 de 400 - 1000 recién nacidos (45). En los primeros estudios electroforéticos realizados en muestras de orina de pacientes con poliquistosis renal (PR), se indicó que en la fase inicial de la enfermedad, con filtración glomerular (FG) conservada, la proteinuria sería cuanti y cualitativamente normal, o de tipo glomerular altamente selectivo (46). Sin embargo, una vez que el deterioro de la función renal ha comenzado, la proteinuria podría ser glomerular, y sólo en fases más avanzadas de insuficiencia renal sería de tipo mixto, glomerular y tubular (46). La excreción urinaria aumentada de Hex, indica una liberación directa de material procedente del túbulo proximal (47, 48). Swedenborg y cols (49), encontraron un aumento de la actividad urinaria de la Hex en pacientes con PR, que estaría relacionada con los cambios de creatinina sérica producidos durante el período de un año. Este es un dato de interés ya que, teniendo en cuenta las alteraciones renales, tanto estructurales como funcionales, encontradas en ratas con PR inducida por difeniltiazol, se ha sugerido que el deterioro de la función renal en las formas clínicas de PR podría ser debido primariamente a alteraciones en el túbulo en lugar de alteraciones glomerulares o vasculares (50). Nuestro objetivo fue hacer un estudio comparativo en pacientes con PRAD de tres marcadores bioquímicos precoces de daño renal como la albúmina, y la actividad total de la Hex y sus isoenzimas en orina, así como la glutatión peroxidasa sérica (GPx EC 1.11.1.9) que ha sido considerada un marcador sensible de la función tubular proximal (51). Asimismo, la GPx es un importante enzima antioxidante, y distintas observaciones sugieren que la severidad de la PR puede estar modulada por el stres-oxidativo (52). Paralelamente también fueron determinados otros marcadores de disfunción renal como la cistatina C, creatinina y urea en suero. En 92 pacientes adultos con PRAD, con y sin insuficiencia renal, y clasificados de acuerdo con un índice ecográfico (tamaño riñones y número de quistes), se encontró una frecuente elevación de la Hex total urinaria y alteración de su perfil isoenzimático, con un 31% de los pacientes normotensos y con normoalbuminuria presentando ya una aumentada proporción relativa de isoenzima Hex B (daño tubular). En el total de pacientes se encontró una correlación parcial (manteniendo edad constante) estadísticamente significativa entre el índice ecográfico y la proporción relativa de isoenzima Hex B. Durante el período de un año, 13 pacientes normotensos con normoalbuminuria, presentaron una significativa disminución de la concentración sérica de cistatina C (aumento filtración glomerular), aunque paralelamente se observó un aumento significativo de la excreción urinaria de albúmina e isoenzima Hex B. Por el contrario, durante el mismo período de tiempo, 29 pacientes hipertensos con microalbuminuria, no presentaron diferencias significativas para estas variables bioquímicas. Estos resultados ponen en evidencia la importante participación del daño tubular en la patogénesis de la PRAD, al tiempo que sugieren que en pacientes normotensos con normoalbuminuria, se produciría en principio un gradual incremento de la filtración glomerular; sin embargo, una vez se instaura la hipertensión con microalbuminuria, la filtración glomerular disminuiría progresivamente aunque de forma mucho más lenta. Bibliografía 1. Salaspuru M, Roine N. 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